Il microrganismo sperimentale usato da François Jacob e Jacques Monod era il comune batterio da laboratorio, l’E. coli, ma molti dei concetti regolatori di base che furono scoperti da Jacob e Monod sono fondamentali per la regolazione cellulare in tutti gli organismi. L’idea chiave è che le proteine non vengono sintetizzate quando non sono necessarie – E. coli conserva le risorse cellulari e l’energia non producendo le tre proteine Lac quando non c’è bisogno di metabolizzare il lattosio, come quando sono disponibili altri zuccheri come il glucosio. La sezione seguente discute come l’E. coli controlla alcuni geni in risposta alle esigenze metaboliche.
Durante la seconda guerra mondiale, Monod stava testando gli effetti delle combinazioni di zuccheri come fonti di nutrimento per E. coli e B. subtilis. Monod stava seguendo studi simili che erano stati condotti da altri scienziati con batteri e lieviti. Ha scoperto che i batteri coltivati con due zuccheri diversi spesso mostravano due fasi di crescita. Per esempio, se il glucosio e il lattosio erano entrambi forniti, il glucosio veniva metabolizzato prima (fase di crescita I, vedi Figura 2) e poi il lattosio (fase di crescita II). Il lattosio non veniva metabolizzato durante la prima parte della curva di crescita diauxica perché la β-galattosidasi non veniva prodotta quando sia il glucosio che il lattosio erano presenti nel mezzo. Monod chiamò questo fenomeno diauxie.
Monod concentrò poi la sua attenzione sull’induzione della formazione di β-galattosidasi che avveniva quando il lattosio era l’unico zucchero nel mezzo di coltura.
Classificazione dei mutanti regolatoriModifica
Una svolta concettuale di Jacob e Monod fu quella di riconoscere la distinzione tra sostanze regolatrici e siti in cui agiscono per cambiare l’espressione genica. Un ex soldato, Jacob ha usato l’analogia di un bombardiere che avrebbe rilasciato il suo carico letale alla ricezione di una speciale trasmissione o segnale radio. Un sistema funzionante richiede sia un trasmettitore a terra che un ricevitore nell’aereo. Ora, supponiamo che il solito trasmettitore sia rotto. Questo sistema può essere fatto funzionare con l’introduzione di un secondo trasmettitore funzionale. Al contrario, ha detto, consideriamo un bombardiere con un ricevitore difettoso. Il comportamento di questo bombardiere non può essere modificato dall’introduzione di un secondo aereo funzionale.
Per analizzare i mutanti regolatori dell’operone lac, Jacob sviluppò un sistema con cui una seconda copia dei geni lac (lacI con il suo promotore, e lacZYA con promotore e operatore) poteva essere introdotta in una singola cellula. Una coltura di tali batteri, che sono diploidi per i geni lac ma altrimenti normali, viene poi testata per il fenotipo regolatore. In particolare, si determina se LacZ e LacY vengono prodotti anche in assenza di IPTG (perché il repressore del lattosio prodotto dal gene mutante non è funzionale). Questo esperimento, in cui i geni o i gruppi di geni sono testati a coppie, è chiamato test di complementazione.
Questo test è illustrato nella figura (lacA è omesso per semplicità). In primo luogo, sono mostrati alcuni stati aploidi (cioè la cellula porta solo una singola copia dei geni lac). Il pannello (a) mostra la repressione, (b) mostra l’induzione da IPTG, e (c) e (d) mostrano l’effetto di una mutazione al gene lacI o all’operatore, rispettivamente. Nel pannello (e) è mostrato il test di complementazione per il repressore. Se una copia dei geni lac porta una mutazione in lacI, ma la seconda copia è wild type per lacI, il fenotipo risultante è normale, ma lacZ è espresso quando esposto all’induttore IPTG. Le mutazioni che interessano il repressore sono dette recessive rispetto al wild type (e che il wild type è dominante), e questo è spiegato dal fatto che il repressore è una piccola proteina che può diffondersi nella cellula. La copia dell’operone lac adiacente al gene lacI difettoso è effettivamente spenta dalla proteina prodotta dalla seconda copia di lacI.
Se lo stesso esperimento viene effettuato utilizzando una mutazione operatore, si ottiene un risultato diverso (pannello (f)). Il fenotipo di una cellula che porta un sito operatore mutante e uno wild type è che LacZ e LacY sono prodotti anche in assenza dell’induttore IPTG; perché il sito operatore danneggiato non permette il legame del repressore per inibire la trascrizione dei geni strutturali. La mutazione dell’operatore è dominante. Quando il sito operatore dove il repressore deve legarsi è danneggiato dalla mutazione, la presenza di un secondo sito funzionale nella stessa cellula non fa alcuna differenza per l’espressione dei geni controllati dal sito mutante.
Una versione più sofisticata di questo esperimento utilizza operoni marcati per distinguere le due copie dei geni lac e mostrare che il gene strutturale non regolato è quello accanto all’operatore mutante (pannello (g). Per esempio, supponiamo che una copia sia segnata da una mutazione che inattiva lacZ in modo che possa produrre solo la proteina LacY, mentre la seconda copia porta una mutazione che colpisce lacY e può produrre solo LacZ. In questa versione, solo la copia dell’operone lac che è adiacente all’operatore mutante è espressa senza IPTG. Diciamo che la mutazione dell’operatore è cis-dominante, è dominante rispetto al wild type ma colpisce solo la copia dell’operone che è immediatamente adiacente ad esso.
Questa spiegazione è fuorviante in un senso importante, perché procede da una descrizione dell’esperimento e poi spiega i risultati in termini di un modello. Ma in realtà, è spesso vero che il modello viene prima, e un esperimento è modellato appositamente per testare il modello. Jacob e Monod hanno prima immaginato che ci deve essere un sito nel DNA con le proprietà dell’operatore, e poi hanno progettato i loro test di complementazione per dimostrarlo.
La dominanza dei mutanti operatore suggerisce anche una procedura per selezionarli specificamente. Se i mutanti regolatori sono selezionati da una cultura di wild type usando fenil-Gal, come descritto sopra, le mutazioni operatore sono rare rispetto ai mutanti repressori perché la dimensione del target è così piccola. Ma se invece iniziamo con un ceppo che porta due copie dell’intera regione lac (che è diploide per lac), le mutazioni repressorie (che ancora si verificano) non vengono recuperate perché la complementazione dal secondo gene lacI di tipo selvatico conferisce un fenotipo di tipo selvatico. Al contrario, la mutazione di una copia dell’operatore conferisce un fenotipo mutante perché è dominante rispetto alla seconda copia di tipo selvatico.
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La spiegazione della diauxie dipendeva dalla caratterizzazione di mutazioni aggiuntive che interessano i geni lac oltre a quelle spiegate dal modello classico. Due altri geni, cya e crp, sono stati successivamente identificati che mappano lontano da lac, e che, quando mutati, risultano in una diminuzione del livello di espressione in presenza di IPTG e anche in ceppi del batterio privi del repressore o dell’operatore. La scoperta del cAMP in E. coli ha portato alla dimostrazione che i mutanti difettosi del gene cya ma non del gene crp potevano essere ripristinati alla piena attività dall’aggiunta di cAMP al mezzo.
Il gene cya codifica l’adenilato ciclasi, che produce cAMP. In un mutante cya, l’assenza di cAMP rende l’espressione dei geni lacZYA più di dieci volte inferiore al normale. L’aggiunta di cAMP corregge la bassa espressione di Lac caratteristica dei mutanti cya. Il secondo gene, crp, codifica una proteina chiamata catabolite activator protein (CAP) o cAMP receptor protein (CRP).
Tuttavia gli enzimi del metabolismo del lattosio sono prodotti in piccole quantità in presenza sia di glucosio che di lattosio (talvolta chiamata espressione leaky) a causa del fatto che il repressore LacI si associa/dissocia rapidamente dal DNA piuttosto che legarsi strettamente ad esso, il che può dare tempo a RNAP di legarsi e trascrivere gli mRNA di lacZYA. L’espressione lenta è necessaria per permettere il metabolismo di un po’ di lattosio dopo che la fonte di glucosio è esaurita, ma prima che l’espressione lac sia completamente attivata.
In sintesi:
- Quando il lattosio è assente allora c’è poca produzione dell’enzima Lac (l’operatore ha il repressore Lac legato ad esso).
- Quando il lattosio è presente ma è presente anche una fonte di carbonio preferita (come il glucosio), viene prodotta una piccola quantità di enzima (il repressore Lac non è legato all’operatore).
- Quando il glucosio è assente, CAP-cAMP si lega a un sito specifico del DNA a monte del promotore e fa un’interazione diretta proteina-proteina con RNAP che facilita il legame di RNAP al promotore.
Il ritardo tra le fasi di crescita riflette il tempo necessario per produrre quantità sufficienti di enzimi che metabolizzano il lattosio. In primo luogo, la proteina regolatrice CAP deve assemblarsi sul promotore lac, con conseguente aumento della produzione di lac mRNA. Un maggior numero di copie disponibili dell’mRNA lac si traduce nella produzione (vedi traduzione) di un numero significativamente maggiore di copie di LacZ (β-galattosidasi, per il metabolismo del lattosio) e LacY (lattosio permeasi per trasportare il lattosio nella cellula). Dopo un ritardo necessario per aumentare il livello degli enzimi che metabolizzano il lattosio, i batteri entrano in una nuova rapida fase di crescita cellulare.
Due enigmi della repressione dei cataboliti riguardano il modo in cui i livelli di cAMP sono accoppiati alla presenza di glucosio, e in secondo luogo, perché le cellule dovrebbero preoccuparsi. Dopo essere stato scisso, il lattosio forma effettivamente glucosio e galattosio (facilmente convertibile in glucosio). In termini metabolici, il lattosio è una fonte di carbonio e di energia altrettanto buona del glucosio. Il livello di cAMP non è legato alla concentrazione intracellulare di glucosio ma al tasso di trasporto del glucosio, che influenza l’attività dell’adenilato ciclasi. (Inoltre, il trasporto di glucosio porta anche all’inibizione diretta della permeasi del lattosio). Per quanto riguarda il motivo per cui l’E. coli lavora in questo modo, si può solo speculare. Tutti i batteri enterici fermentano il glucosio, il che suggerisce che lo incontrano frequentemente. È possibile che una piccola differenza nell’efficienza del trasporto o del metabolismo del glucosio contro il lattosio renda vantaggioso per le cellule regolare l’operone lac in questo modo.