Experimentálním mikroorganismem, který použili François Jacob a Jacques Monod, byla běžná laboratorní bakterie E. coli, ale mnohé ze základních regulačních konceptů, které Jacob a Monod objevili, jsou zásadní pro buněčnou regulaci všech organismů. Klíčovou myšlenkou je, že bílkoviny se nesyntetizují, když nejsou potřeba – E. coli šetří buněčné zdroje a energii tím, že nevytváří tři Lacovy bílkoviny, když není potřeba metabolizovat laktózu, například když jsou k dispozici jiné cukry, například glukóza. Následující část pojednává o tom, jak E. coli řídí některé geny v reakci na metabolické potřeby.
Během druhé světové války Monod testoval účinky kombinací cukrů jako zdrojů živin pro E. coli a B. subtilis. Monod navazoval na podobné studie, které prováděli jiní vědci s bakteriemi a kvasinkami. Zjistil, že bakterie pěstované se dvěma různými cukry často vykazovaly dvě fáze růstu. Například pokud byla k dispozici glukóza i laktóza, byla nejprve metabolizována glukóza (fáze růstu I, viz obrázek 2) a poté laktóza (fáze růstu II). Laktóza nebyla metabolizována během první části diauxické růstové křivky, protože β-galaktosidáza se nevytvářela, když byly v médiu přítomny glukóza i laktóza. Monod tento jev nazval diauxie.
Monod poté zaměřil svou pozornost na indukci tvorby β-galaktosidázy, ke které docházelo, když byla jediným cukrem v kultivačním médiu laktóza.
Klasifikace regulačních mutantůUpravit
Koncepčním průlomem Jacoba a Monoda bylo rozpoznání rozdílu mezi regulačními látkami a místy, kde působí na změnu genové exprese. Jacob, bývalý voják, použil analogii bombardéru, který uvolní svůj smrtící náklad po přijetí speciálního rádiového vysílání nebo signálu. Fungující systém vyžaduje jak pozemní vysílač, tak přijímač v letadle. Nyní předpokládejme, že obvyklý vysílač je rozbitý. Tento systém lze zprovoznit zavedením druhého funkčního vysílače. Naproti tomu, řekl, uvažujme bombardér s vadným přijímačem. Chování tohoto bombardéru nelze změnit zavedením druhého, funkčního letadla.
Pro analýzu regulačních mutantů operonu lac vyvinul Jacob systém, pomocí něhož lze do jedné buňky zavést druhou kopii genů lac (lacI s jeho promotorem a lacZYA s promotorem a operátorem). Kultura takových bakterií, které jsou diploidní pro lac geny, ale jinak normální, se pak testuje na regulační fenotyp. Zejména se zjišťuje, zda se LacZ a LacY tvoří i v nepřítomnosti IPTG (v důsledku nefunkčnosti represoru laktózy produkovaného mutantním genem). Tento pokus, při němž se geny nebo shluky genů testují párově, se nazývá komplementační test.
Tento test je znázorněn na obrázku (lacA je pro zjednodušení vynechán). Nejprve jsou zobrazeny určité haploidní stavy (tj. buňka nese pouze jednu kopii genů lac). Panel (a) ukazuje represi, (b) indukci pomocí IPTG a (c) a (d) ukazují účinek mutace genu lacI, resp. operátoru. Na panelu (e) je znázorněn komplementační test pro represor. Pokud jedna kopie genů lac nese mutaci v lacI, ale druhá kopie je divoký typ pro lacI, výsledný fenotyp je normální – ale lacZ je exprimován při vystavení induktoru IPTG. O mutacích postihujících represor se říká, že jsou recesivní vůči divokému typu (a že divoký typ je dominantní), což se vysvětluje tím, že represor je malý protein, který může v buňce difundovat. Kopie lac operonu sousedící s defektním genem lacI je účinně vypnuta proteinem produkovaným z druhé kopie lacI.
Provede-li se stejný experiment s použitím operátorové mutace, získá se jiný výsledek (panel f)). Fenotyp buňky nesoucí jedno mutované a jedno operátorové místo divokého typu je takový, že LacZ a LacY jsou produkovány i v nepřítomnosti induktoru IPTG; protože poškozené operátorové místo, neumožňuje vazbu represoru, který by inhiboval transkripci strukturních genů. Operátorová mutace je dominantní. Když je operátorové místo, na které se musí vázat represor, poškozeno mutací, přítomnost druhého funkčního místa v téže buňce neovlivňuje expresi genů řízených mutovaným místem.
Složitější verze tohoto experimentu používá označené operony k rozlišení dvou kopií lac genů a ukazuje, že neregulovaný(é) strukturní gen(y) je(jsou) ten(é) vedle mutovaného operátoru (panel g). Předpokládejme například, že jedna kopie je označena mutací inaktivující lacZ, takže může produkovat pouze protein LacY, zatímco druhá kopie nese mutaci ovlivňující lacY a může produkovat pouze LacZ. V této verzi je bez IPTG exprimována pouze ta kopie lac operonu, která sousedí s mutovaným operátorem. Říkáme, že mutace operátoru je cis-dominantní, je dominantní vůči divokému typu, ale ovlivňuje pouze kopii operonu, která s ní bezprostředně sousedí.
Toto vysvětlení je v důležitém smyslu zavádějící, protože vychází z popisu experimentu a výsledky pak vysvětluje pomocí modelu. Ve skutečnosti však často platí, že model je na prvním místě a experiment je vytvořen speciálně pro testování modelu. Jacob a Monod si nejprve představili, že v DNA musí existovat místo s vlastnostmi operátoru, a pak navrhli své komplementační testy, aby to prokázali.
Dominance operátorových mutantů také naznačuje postup jejich specifického výběru. Pokud jsou regulační mutanti vybíráni z kultury divokého typu pomocí fenyl-Galu, jak je popsáno výše, jsou operátorové mutace ve srovnání s represorovými mutanty vzácné, protože velikost cíle je velmi malá. Pokud však místo toho začneme s kmenem, který nese dvě kopie celé oblasti lac (tj. diploidní pro lac), represorové mutace (které se přesto vyskytují) se neobnoví, protože komplementace druhým, divokým typem genu lacI propůjčuje fenotyp divokého typu. Naproti tomu mutace jedné kopie operátoru propůjčuje mutantní fenotyp, protože je dominantní vůči druhé, divoké kopii typu.
Regulace cyklickým AMPEdit
Vysvětlení diauxie záviselo na charakterizaci dalších mutací ovlivňujících geny lac, které nejsou vysvětleny klasickým modelem. Následně byly identifikovány dva další geny, cya a crp, které se mapují daleko od lac a které po mutaci vedou ke snížené úrovni exprese v přítomnosti IPTG a dokonce i u kmenů bakterie postrádajících represor nebo operátor. Objev cAMP v E. coli vedl k prokázání, že mutanty s defektním genem cya, ale nikoli genem crp, lze obnovit na plnou aktivitu přidáním cAMP do média.
Gen cya kóduje adenylátcyklázu, která produkuje cAMP. U mutanta cya je při nepřítomnosti cAMP exprese genů lacZYA více než desetkrát nižší než normálně. Přidání cAMP koriguje nízkou expresi Lac charakteristickou pro mutanty cya. Druhý gen, crp, kóduje protein nazývaný protein katabolitového aktivátoru (CAP) nebo protein cAMP receptoru (CRP).
Enzymy metabolismu laktózy se však v přítomnosti glukózy i laktózy vytvářejí v malém množství (někdy se tomu říká děravá exprese) díky tomu, že represor LacI se rychle asociuje/disociuje z DNA, místo aby se na ni pevně vázal, což může poskytnout čas RNAP k navázání a přepisu mRNA lacZYA. Děravá exprese je nutná proto, aby se umožnil metabolismus části laktózy po vyčerpání zdroje glukózy, ale před plnou aktivací exprese lac.
Shrnuto:
- Když není přítomna laktóza, pak dochází k velmi malé produkci enzymu Lac (operátor má navázaný represor Lac).
- Když je laktóza přítomna, ale je přítomen i preferovaný zdroj uhlíku (např. glukóza), pak se produkuje malé množství enzymu (represor Lac není vázán na operátor).
- Když glukóza chybí, CAP-cAMP se váže na specifické místo DNA před promotorem a vytváří přímou protein-proteinovou interakci s RNAP, která usnadňuje vazbu RNAP na promotor.
Zpoždění mezi fázemi růstu odráží dobu potřebnou k produkci dostatečného množství enzymů metabolizujících laktózu. Nejprve se musí regulační protein CAP shromáždit na promotoru lac, což vede ke zvýšení produkce mRNA lac. Více dostupných kopií lac mRNA má za následek produkci (viz translace) výrazně většího počtu kopií LacZ (β-galaktosidáza, pro metabolismus laktózy) a LacY (laktóza permeáza pro transport laktózy do buňky). Po prodlevě potřebné ke zvýšení hladiny enzymů metabolizujících laktózu vstoupí bakterie do nové rychlé fáze buněčného růstu.
Dvě záhady katabolitové represe se týkají toho, jak je hladina cAMP spojena s přítomností glukózy, a za druhé, proč by se tím buňky měly vůbec zabývat. Po rozštěpení laktózy z ní skutečně vzniká glukóza a galaktóza (snadno přeměnitelná na glukózu). Z metabolického hlediska je laktóza stejně dobrým zdrojem uhlíku a energie jako glukóza. Hladina cAMP nesouvisí s intracelulární koncentrací glukózy, ale s rychlostí transportu glukózy, což ovlivňuje aktivita adenylátcyklázy. (Kromě toho vede transport glukózy také k přímé inhibici laktózové permeázy). O tom, proč E. coli funguje tímto způsobem, lze jen spekulovat. Všechny střevní bakterie fermentují glukózu, což naznačuje, že se s ní setkávají často. Je možné, že malý rozdíl v účinnosti transportu nebo metabolismu glukózy v. laktózy způsobuje, že je pro buňky výhodné regulovat lac operon tímto způsobem
.