François Jacobin ja Jacques Monodin käyttämä koemikro-organismi oli tavallinen laboratoriobakteeri E. coli, mutta monet Jacobin ja Monodin löytämistä säätelyn peruskäsitteistä ovat perustavanlaatuisia solujen säätelyssä kaikissa organismeissa. Keskeinen ajatus on, että proteiineja ei syntetisoida silloin, kun niitä ei tarvita – E. coli säästää solun resursseja ja energiaa jättämällä valmistamatta kolmea Lac-proteiinia silloin, kun laktoosin aineenvaihduntaa ei tarvita, kuten silloin, kun muita sokereita, kuten glukoosia, on saatavilla. Seuraavassa jaksossa käsitellään sitä, miten E. coli kontrolloi tiettyjä geenejä vastauksena aineenvaihdunnan tarpeisiin.
Toisen maailmansodan aikana Monod testasi sokeriyhdistelmien vaikutuksia E. colin ja B. subtiliksen ravinnelähteinä. Monod seurasi vastaavia tutkimuksia, joita muut tutkijat olivat tehneet bakteereilla ja hiivalla. Hän havaitsi, että kahdella eri sokerilla kasvatetuilla bakteereilla oli usein kaksi kasvuvaihetta. Jos esimerkiksi annettiin sekä glukoosia että laktoosia, glukoosi metaboloitui ensin (kasvuvaihe I, ks. kuva 2) ja sitten laktoosi (kasvuvaihe II). Laktoosia ei metaboloitu diauksisen kasvukäyrän ensimmäisen osan aikana, koska β-galaktosidaasia ei valmistettu, kun väliaineessa oli sekä glukoosia että laktoosia. Monod nimesi tämän ilmiön diauxieksi.
Monod kiinnitti tämän jälkeen huomionsa β-galaktosidaasin muodostumisen induktioon, joka tapahtui silloin, kun laktoosia oli ainoana sokerina elatusaineessa.
Regulaattorimutaatioiden luokitteluEdit
Jacobin ja Monodin käsitteellinen läpimurto oli tunnistaa ero säätelyaineiden ja niiden paikkojen välillä, joissa ne vaikuttavat geeniekspression muuttamiseen. Entinen sotilas Jacob käytti analogiaa pommikoneesta, joka vapauttaa tappavan lastinsa saatuaan erityisen radiolähetyksen tai signaalin. Toimiva järjestelmä edellyttää sekä maassa olevaa lähetintä että lentokoneessa olevaa vastaanotinta. Oletetaan nyt, että tavallinen lähetin on rikki. Järjestelmä voidaan saada toimimaan ottamalla käyttöön toinen, toimiva lähetin. Sitä vastoin, hän sanoi, ajatellaan pommikonetta, jossa on viallinen vastaanotin. Tämän pommikoneen käyttäytymistä ei voida muuttaa tuomalla siihen toinen, toimiva lentokone.
Analysoidakseen lac-operonin säätelymutantteja Jacob kehitti järjestelmän, jolla lac-geeneistä (lacI promoottorineen ja lacZYA promoottorineen ja operaattorineen) voitiin tuoda toinen kopio yhteen soluun. Tällaisen bakteeriviljelmän, joka on diploidi lac-geenien osalta mutta muuten normaali, testataan sitten säätelyfenotyypin osalta. Erityisesti määritetään, syntyykö LacZ ja LacY myös ilman IPTG:tä (koska mutanttigeenin tuottama laktoosirepressori ei toimi). Tätä koetta, jossa geenejä tai geeniryhmiä testataan pareittain, kutsutaan komplementaatiotestiksi.
Tämä koe on havainnollistettu kuvassa (lacA on jätetty pois yksinkertaisuuden vuoksi). Ensin esitetään tietyt haploidiset tilat (eli solu kantaa vain yhtä kopiota lac-geeneistä). Paneelissa (a) näkyy repressio, (b) IPTG:n induktio ja (c) ja (d) lacI-geenin tai operaattorin mutaation vaikutus. Paneelissa (e) esitetään komplementtitesti repressorin osalta. Jos toisessa lac-geenin kopiossa on mutaatio lacI:ssä, mutta toinen kopio on villiä tyyppiä lacI:n suhteen, tuloksena on normaali fenotyyppi – mutta lacZ ekspressoituu, kun sitä altistetaan induktorille IPTG. Mutaatioiden, jotka vaikuttavat repressoriin, sanotaan olevan resessiivisiä villityyppiin nähden (ja että villityyppi on dominoiva), ja tämä selittyy sillä, että repressori on pieni proteiini, joka voi diffundoitua solussa. Viallisen lacI-geenin viallisen lacI-geenin vieressä oleva lac-operonin kopio sulkeutuu tehokkaasti lacI:n toisesta kopiosta tuotetulla proteiinilla.
Jos sama koe tehdään käyttämällä operaattorimutaatiota, saadaan erilainen tulos (paneeli (f)). Fenotyyppi solussa, jossa on yksi mutantti- ja yksi villityyppinen operaattorikohta, on se, että LacZ- ja LacY-geenejä tuotetaan myös ilman induktoria IPTG:tä; koska vaurioitunut operaattorikohta ei salli repressorin sitoutumista estämään rakennegeenien transkriptiota. Operaattorimutaatio on dominoiva. Kun mutaatio vaurioittaa operaattoripaikkaa, johon repressorin on sitouduttava, toisen funktionaalisen paikan olemassaolo samassa solussa ei vaikuta mutanttipaikan kontrolloimien geenien ilmentymiseen.
Tämän kokeen kehittyneemmässä versiossa käytetään merkittyjä operoneja, jotta voidaan erottaa toisistaan lac-geenien kaksi kopiota, ja osoitetaan, että sääntelemätön(t) rakenteellinen/rakenteelliset geen(eet) on(vat) mutanttioperaattorin vieressä oleva/olevat geeni/geenit (paneeli (g). Oletetaan esimerkiksi, että toinen kopio on merkitty mutaatiolla, joka inaktivoi lacZ:n niin, että se voi tuottaa vain LacY-proteiinia, kun taas toisessa kopiossa on mutaatio, joka vaikuttaa lacY:hen ja voi tuottaa vain LacZ:tä. Tässä versiossa vain se lac-operonin kopio, joka on mutanttioperaattorin vieressä, ilmentyy ilman IPTG:tä. Sanomme, että operaattorimutaatio on cis-dominantti, se on dominoiva villityyppiin nähden, mutta vaikuttaa vain siihen operonin kopioon, joka on sen välittömässä läheisyydessä.
Tämä selitys on tärkeässä mielessä harhaanjohtava, koska siinä lähdetään liikkeelle kokeen kuvauksesta ja sen jälkeen selitetään tulokset mallin avulla. Tosiasiassa on kuitenkin usein niin, että malli tulee ensin, ja koe suunnitellaan nimenomaan mallin testaamiseksi. Jacob ja Monod kuvittelivat ensin, että DNA:ssa täytyy olla paikka, jolla on operaattorin ominaisuuksia, ja suunnittelivat sitten komplementtikokeensa osoittamaan tämän.
Operaattorimutaatioiden dominoivuus viittaa myös menettelyyn, jolla ne valitaan erityisesti. Jos säätelymutaatiot valitaan villin tyypin viljelystä fenyyli-Galilla, kuten edellä on kuvattu, operaattorimutaatiot ovat harvinaisia verrattuna repressorimutaatioihin, koska kohdekoko on niin pieni. Mutta jos sen sijaan aloitetaan kannasta, joka kantaa kahta kopiota koko lac-alueesta (eli on diploidi lac:lle), repressorimutaatioita (joita silti esiintyy) ei saada talteen, koska komplementaatio toisen, villityyppisen lacI-geenin kanssa antaa villityyppisen fenotyypin. Sitä vastoin operaattorin yhden kopion mutaatio antaa mutanttisen fenotyypin, koska se on dominoiva toiseen, villityyppiseen kopioon nähden.
Syklisen AMPEdit:n säätely
Diauxien selittäminen riippui muiden lac-geeneihin vaikuttavien lisämutaatioiden luonnehtimisesta kuin klassisen mallin selittämien. Sittemmin tunnistettiin kaksi muuta geeniä, cya ja crp, jotka karttuivat kauas lac:stä ja jotka mutaationa johtavat vähentyneeseen ilmentymistasoon IPTG:n läsnä ollessa ja jopa bakteerikannoissa, joista puuttuu repressori tai operaattori. CAMP:n löytyminen E. colissa johti sen osoittamiseen, että cya-geenin mutta ei crp-geenin vialliset mutantit voitiin palauttaa täyteen aktiivisuuteen lisäämällä väliaineeseen cAMP:ia.
Cya-geeni koodaa adenylaattisyklaasia, joka tuottaa cAMP:ia. cya-mutantissa cAMP:n puuttuminen saa lacZYA-geenien ilmentymisen yli kymmenkertaiseksi normaaliin verrattuna. CAMP:n lisääminen korjaa cya-mutaatioille ominaisen alhaisen Lac-ekspression. Toinen geeni, crp, koodaa proteiinia, jota kutsutaan kataboliittiaktivaattoriproteiiniksi (CAP) tai cAMP-reseptoriproteiiniksi (CRP).
Laktoosiaineenvaihdunnan entsyymejä valmistetaan kuitenkin pieniä määriä sekä glukoosin että laktoosin läsnäollessa (tätä kutsutaan toisinaan vuotavaksi ekspressioksi), mikä johtuu siitä, että LacI-repressori assosioituu/dissosioituu nopeasti DNA:sta sen sijaan, että se olisi tiukasti sidoksissa DNA:han, jolloin RNAP:lla voi olla aikaa sitoutua ja transkriptioida mRNA:ta LacZYA:ta. Vuotava ilmentyminen on välttämätöntä, jotta jonkin verran laktoosia voi metaboloitua sen jälkeen, kun glukoosilähde on kulutettu, mutta ennen kuin lac-ilmentyminen aktivoituu täysin.
Yhteenvetona:
- Kun laktoosia ei ole, silloin Lac-entsyymin tuotanto on hyvin vähäistä (operaattorissa on Lac-repressori sitoutuneena siihen).
- Kun laktoosia on läsnä, mutta myös jokin ensisijainen hiililähde (kuten glukoosi) on läsnä, silloin entsyymiä tuotetaan pieni määrä (Lac-repressori ei ole sitoutunut operaattoriin).
- Kun glukoosia ei ole, CAP-cAMP sitoutuu spesifiseen DNA-kohtaan promoottorin yläjuoksulla ja tekee suoran proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen RNAP:n kanssa, mikä helpottaa RNAP:n sitoutumista promoottoriin.
Kasvuvaiheiden välinen viive kuvastaa aikaa, joka tarvitaan laktoosia metaboloivien entsyymien riittävien määrien tuottamiseen. Ensin CAP-säätelyproteiinin on kokoonnuttava lac-promoottoriin, mikä johtaa lac-mRNA:n tuotannon lisääntymiseen. Enemmän käytettävissä olevia lac-mRNA-kopioita johtaa siihen, että LacZ:n (β-galaktosidaasi, laktoosiaineenvaihduntaa varten) ja LacY:n (laktoosipermeaasi, joka kuljettaa laktoosia soluun) kopioita tuotetaan (ks. käännös) huomattavasti enemmän. Laktoosia metaboloivien entsyymien määrän kasvattamiseen tarvittavan viiveen jälkeen bakteerit siirtyvät uuteen nopeaan solukasvuvaiheeseen.
Kaksi kataboliittirepression arvoitusta liittyvät siihen, miten cAMP-tasot kytkeytyvät glukoosin läsnäoloon ja toiseksi siihen, miksi solujen pitäisi ylipäätään vaivautua. Laktoosin pilkkomisen jälkeen siitä muodostuu itse asiassa glukoosia ja galaktoosia (joka muuntuu helposti glukoosiksi). Aineenvaihdunnan kannalta laktoosi on yhtä hyvä hiilen ja energian lähde kuin glukoosi. CAMP-taso ei liity solunsisäiseen glukoosipitoisuuteen vaan glukoosin kuljetusnopeuteen, joka vaikuttaa adenylaattisyklaasin aktiivisuuteen. (Lisäksi glukoosin kuljetus johtaa myös laktoosipermeaasin suoraan estymiseen). Siitä, miksi E. coli toimii näin, voidaan vain spekuloida. Kaikki enterobakteerit fermentoivat glukoosia, mikä viittaa siihen, että ne kohtaavat sitä usein. On mahdollista, että pieni ero glukoosin vs. laktoosin kuljetuksen tai aineenvaihdunnan tehokkuudessa tekee soluille edulliseksi säädellä lac-operonia tällä tavalla.