Microorganismul experimental folosit de François Jacob și Jacques Monod a fost o bacterie obișnuită de laborator, E. coli, dar multe dintre conceptele de bază ale reglării descoperite de Jacob și Monod sunt fundamentale pentru reglarea celulară în toate organismele. Ideea cheie este că proteinele nu sunt sintetizate atunci când nu sunt necesare – E. coli conservă resursele celulare și energia prin faptul că nu produce cele trei proteine Lac atunci când nu este nevoie să metabolizeze lactoza, cum ar fi atunci când sunt disponibile alte zaharuri precum glucoza. Următoarea secțiune analizează modul în care E. coli controlează anumite gene ca răspuns la nevoile metabolice.
În timpul celui de-al Doilea Război Mondial, Monod a testat efectele combinațiilor de zaharuri ca surse de nutrienți pentru E. coli și B. subtilis. Monod urmărea studii similare care fuseseră efectuate de alți oameni de știință cu bacterii și drojdii. El a descoperit că bacteriile cultivate cu două zaharuri diferite prezentau adesea două faze de creștere. De exemplu, dacă se furniza glucoză și lactoză, glucoza era metabolizată mai întâi (faza de creștere I, a se vedea figura 2) și apoi lactoza (faza de creștere II). Lactoza nu a fost metabolizată în prima parte a curbei de creștere diauxică, deoarece β-galactozidaza nu a fost produsă atunci când în mediu erau prezente atât glucoza, cât și lactoza. Monod a numit acest fenomen diauxie.
Monod și-a concentrat apoi atenția asupra inducerii formării de β-galactosidază care a avut loc atunci când lactoza era singurul zahăr din mediul de cultură.
Clasificarea mutanților reglatoriEdit
O descoperire conceptuală a lui Jacob și Monod a fost aceea de a recunoaște distincția dintre substanțele reglatoare și locurile în care acestea acționează pentru a modifica expresia genică. Fost soldat, Jacob a folosit analogia cu un bombardier care își elibera încărcătura letală la primirea unei transmisii sau a unui semnal radio special. Un sistem funcțional necesită atât un emițător la sol, cât și un receptor în avion. Acum, să presupunem că emițătorul obișnuit este stricat. Acest sistem poate fi făcut să funcționeze prin introducerea unui al doilea emițător funcțional. În schimb, a spus el, luați în considerare un bombardier cu un receptor defect. Comportamentul acestui bombardier nu poate fi schimbat prin introducerea unui al doilea avion funcțional.
Pentru a analiza mutanții reglatori ai operonului lac, Jacob a dezvoltat un sistem prin care o a doua copie a genelor lac (lacI cu promotorul său și lacZYA cu promotor și operator) poate fi introdusă într-o singură celulă. O cultură de astfel de bacterii, care sunt diploide pentru genele lac, dar normale în rest, este apoi testată pentru fenotipul reglator. În special, se determină dacă LacZ și LacY sunt produse chiar și în absența IPTG (datorită faptului că reprimatorul de lactoză produs de gena mutantă este nefuncțional). Acest experiment, în care genele sau grupurile de gene sunt testate pe perechi, se numește test de complementaritate.
Acest test este ilustrat în figură (lacA este omisă pentru simplificare). În primul rând, sunt prezentate anumite stări haploide (adică celula poartă doar o singură copie a genelor lac). Panoul (a) arată represiunea, (b) arată inducția prin IPTG, iar (c) și (d) arată efectul unei mutații la nivelul genei lacI sau, respectiv, al operatorului. În panoul (e) este prezentat testul de completare pentru represor. În cazul în care o copie a genelor lac poartă o mutație în lacI, dar a doua copie este de tip sălbatic pentru lacI, fenotipul rezultat este normal – dar lacZ se exprimă atunci când este expusă la inductorul IPTG. Se spune că mutațiile care afectează reprimatorul sunt recesive față de tipul sălbatic (și că tipul sălbatic este dominant), iar acest lucru se explică prin faptul că reprimatorul este o proteină mică care poate difuza în celulă. Copia operonului lac adiacentă genei lacI defecte este efectiv închisă de proteina produsă de cea de-a doua copie a genei lacI.
Dacă se efectuează același experiment folosind o mutație de operator, se obține un rezultat diferit (panoul (f)). Fenotipul unei celule care poartă un situs de operator mutant și unul de tip sălbatic este că LacZ și LacY sunt produse chiar și în absența inductorului IPTG; deoarece situsul de operator deteriorat, nu permite legarea represorului pentru a inhiba transcrierea genelor structurale. Mutația operatorului este dominantă. Atunci când situsul operatorului unde trebuie să se lege represorul este deteriorat prin mutație, prezența unui al doilea situs funcțional în aceeași celulă nu face nici o diferență în ceea ce privește expresia genelor controlate de situsul mutant.
O versiune mai sofisticată a acestui experiment folosește operoni marcați pentru a distinge între cele două copii ale genelor lac și pentru a arăta că gena (genele) structurală (structurale) nereglementată (nereglementate) este (sunt) cea (cele) de lângă operatorul mutant (panoul (g). De exemplu, să presupunem că o copie este marcată de o mutație care inactivează lacZ, astfel încât poate produce doar proteina LacY, în timp ce a doua copie poartă o mutație care afectează lacY și poate produce doar LacZ. În această versiune, numai copia operonului lac care este adiacentă operatorului mutant este exprimată fără IPTG. Spunem că mutația operatorului este cis-dominantă, este dominantă față de tipul sălbatic, dar afectează numai copia operonului care este imediat adiacentă acestuia.
Această explicație este înșelătoare într-un sens important, deoarece pornește de la o descriere a experimentului și apoi explică rezultatele în termenii unui model. Dar, de fapt, este adesea adevărat că modelul vine mai întâi, iar un experiment este modelat special pentru a testa modelul. Jacob și Monod și-au imaginat mai întâi că trebuie să existe un situs în ADN cu proprietățile operatorului, iar apoi au conceput testele lor de complementare pentru a demonstra acest lucru.
Dominanța mutanților operatorului sugerează, de asemenea, o procedură de selectare specifică a acestora. Dacă mutanții regulatori sunt selectați dintr-o cultură de tip sălbatic folosind fenil-Gal, așa cum s-a descris mai sus, mutațiile de operator sunt rare în comparație cu mutanții represori, deoarece dimensiunea țintei este foarte mică. Dar dacă, în schimb, se pornește de la o tulpină care poartă două copii ale întregii regiuni lac (care este diploidă pentru lac), mutațiile represoare (care încă apar) nu sunt recuperate, deoarece complementarea cu a doua genă lacI de tip sălbatic conferă un fenotip de tip sălbatic. În schimb, mutația unei singure copii a operatorului conferă un fenotip mutant deoarece este dominantă față de cea de-a doua copie, de tip sălbatic.
Reglarea prin AMPEdit ciclic
Explicarea dialeziei a depins de caracterizarea mutațiilor suplimentare care afectează genele lac, altele decât cele explicate de modelul clasic. Ulterior, au fost identificate alte două gene, cya și crp, care au fost cartografiate departe de lac și care, atunci când sunt mutate, au ca rezultat o scădere a nivelului de expresie în prezența IPTG și chiar în tulpinile de bacterie lipsite de represor sau operator. Descoperirea cAMP în E. coli a dus la demonstrarea faptului că mutanții defectuoși ai genei cya, dar nu și ai genei crp, pot fi readuși la o activitate completă prin adăugarea de cAMP în mediu.
Gena cya codifică adenilatciclaza, care produce cAMP. La un mutant cya, absența cAMP face ca expresia genelor lacZYA să fie de peste zece ori mai mică decât în mod normal. Adăugarea de AMPc corectează expresia Lac scăzută caracteristică mutanților cya. Cea de-a doua genă, crp, codifică o proteină numită proteină activatoare de catabolit (CAP) sau proteină receptoare de AMPc (CRP).
Cu toate acestea, enzimele metabolismului lactozei sunt produse în cantități mici atât în prezența glucozei, cât și a lactozei (uneori numită expresie cu scurgeri), datorită faptului că represorul LacI se asociază/disociază rapid de ADN, mai degrabă decât să se lege strâns de acesta, ceea ce poate lăsa timp pentru ca RNAP să se lege și să transcrie ARNm al lacZYA. Expresia scăpată este necesară pentru a permite metabolizarea unei părți din lactoză după ce sursa de glucoză este consumată, dar înainte ca expresia lac să fie activată complet.
În rezumat:
- Când lactoza este absentă, atunci există foarte puțină producție a enzimei Lac (operatorul are reprimatorul Lac legat de el).
- Când lactoza este prezentă, dar este prezentă și o sursă preferată de carbon (cum ar fi glucoza), atunci se produce o cantitate mică de enzimă (reprimatorul Lac nu este legat de operator).
- Când lipsește glucoza, CAP-cAMP se leagă de un sit specific de ADN în amonte de promotor și realizează o interacțiune directă proteină-proteină cu RNAP care facilitează legarea RNAP la promotor.
Târzierea dintre fazele de creștere reflectă timpul necesar pentru a produce cantități suficiente de enzime metabolizatoare de lactoză. În primul rând, proteina regulatoare CAP trebuie să se adune pe promotorul lac, ceea ce duce la o creștere a producției de ARNm lac. Un număr mai mare de copii disponibile ale ARNm lac duce la producerea (a se vedea traducerea) unui număr semnificativ mai mare de copii ale LacZ (β-galactosidază, pentru metabolizarea lactozei) și LacY (lactoză permează pentru a transporta lactoza în celulă). După o întârziere necesară pentru a crește nivelul enzimelor care metabolizează lactoza, bacteria intră într-o nouă fază rapidă de creștere celulară.
Două enigme ale represiunii catabolitelor se referă la modul în care nivelurile de AMPc sunt cuplate la prezența glucozei și, în al doilea rând, la motivul pentru care celulele ar trebui să se deranjeze. După ce lactoza este scindată, ea formează de fapt glucoză și galactoză (ușor de transformat în glucoză). Din punct de vedere metabolic, lactoza este o sursă de carbon și de energie la fel de bună ca și glucoza. Nivelul de AMPc nu este legat de concentrația intracelulară de glucoză, ci de rata de transport a glucozei, care influențează activitatea adenilatciclazei. (În plus, transportul glucozei duce, de asemenea, la inhibarea directă a permeazei lactozei). În ceea ce privește motivul pentru care E. coli funcționează în acest mod, se poate doar specula. Toate bacteriile enterice fermentează glucoza, ceea ce sugerează că o întâlnesc frecvent. Este posibil ca o mică diferență în eficiența transportului sau a metabolismului glucozei față de lactoză să facă avantajos pentru celule să regleze operonul lac în acest mod.
.