Het experimentele micro-organisme dat François Jacob en Jacques Monod gebruikten was de gewone laboratoriumbacterie E. coli, maar veel van de basisconcepten voor regulering die door Jacob en Monod werden ontdekt, zijn fundamenteel voor cellulaire regulering in alle organismen. Het sleutelidee is dat eiwitten niet worden aangemaakt wanneer ze niet nodig zijn – E. coli spaart cellulaire hulpbronnen en energie door de drie Lac-eiwitten niet aan te maken wanneer er geen noodzaak is om lactose te metaboliseren, zoals wanneer andere suikers zoals glucose beschikbaar zijn. In het volgende hoofdstuk wordt besproken hoe E. coli bepaalde genen aanstuurt in reactie op metabolische behoeften.
Tijdens de Tweede Wereldoorlog testte Monod de effecten van combinaties van suikers als voedingsbronnen voor E. coli en B. subtilis. Monod volgde op soortgelijke studies die door andere wetenschappers waren uitgevoerd met bacteriën en gist. Hij ontdekte dat bacteriën gekweekt met twee verschillende suikers vaak twee fasen van groei vertoonden. Als bijvoorbeeld zowel glucose als lactose werden toegediend, werd eerst glucose gemetaboliseerd (groeifase I, zie figuur 2) en daarna lactose (groeifase II). Lactose werd niet gemetaboliseerd tijdens het eerste deel van de diauxiegroeicurve omdat β-galactosidase niet werd aangemaakt wanneer zowel glucose als lactose in het medium aanwezig waren. Monod noemde dit verschijnsel diauxie.
Monod richtte zijn aandacht vervolgens op de inductie van β-galactosidase-vorming die optrad wanneer lactose de enige suiker in het kweekmedium was.
Indeling van regulerende mutantenEdit
Een conceptuele doorbraak van Jacob en Monod was de erkenning van het onderscheid tussen regulerende stoffen en de plaatsen waar zij optreden om de genexpressie te veranderen. Als voormalig soldaat gebruikte Jacob de analogie van een bommenwerper die zijn dodelijke lading zou vrijlaten na ontvangst van een speciale radiotransmissie of signaal. Een werkend systeem vereist zowel een grondzender als een ontvanger in het vliegtuig. Stel nu dat de gebruikelijke zender kapot is. Dit systeem kan werkend worden gemaakt door een tweede, functionele zender in te brengen. Daarentegen, zei hij, neem een bommenwerper met een defecte ontvanger. Het gedrag van deze bommenwerper kan niet worden veranderd door de introductie van een tweede, functioneel vliegtuig.
Om regulatiemutanten van het lac operon te analyseren, ontwikkelde Jacob een systeem waarmee een tweede kopie van de lac genen (lacI met zijn promotor, en lacZYA met promotor en operator) in een enkele cel kon worden ingebracht. Een kweek van dergelijke bacteriën, die diploïd zijn voor de lac-genen maar verder normaal, wordt dan getest op het regulatorische fenotype. In het bijzonder wordt nagegaan of LacZ en LacY worden aangemaakt, zelfs bij afwezigheid van IPTG (omdat de door het mutante gen geproduceerde lactose-repressor niet functioneel is). Dit experiment, waarbij genen of genclusters paarsgewijs worden getest, wordt een complementatietest genoemd.
Deze test wordt in de figuur geïllustreerd (lacA is omwille van de eenvoud weggelaten). Eerst worden bepaalde haploïde toestanden getoond (d.w.z. de cel draagt slechts een enkele kopie van de lac-genen). Paneel (a) toont repressie, (b) toont inductie door IPTG, en (c) en (d) tonen het effect van een mutatie in respectievelijk het lacI-gen of de operator. In paneel (e) is de complementatietest voor de repressor weergegeven. Als één kopie van het lac-gen een mutatie in lacI draagt, maar de tweede kopie is wildtype voor lacI, is het resulterende fenotype normaal, maar komt lacZ tot expressie bij blootstelling aan de inducer IPTG. Van mutaties die de repressor beïnvloeden wordt gezegd dat zij recessief zijn ten opzichte van het wildtype (en dat het wildtype dominant is), en dit wordt verklaard door het feit dat de repressor een klein eiwit is dat zich in de cel kan verspreiden. Het exemplaar van het lac-operon dat grenst aan het defecte lacI-gen wordt effectief uitgeschakeld door eiwit dat wordt geproduceerd uit het tweede exemplaar van lacI.
Als hetzelfde experiment wordt uitgevoerd met gebruikmaking van een operator-mutatie, wordt een ander resultaat verkregen (paneel (f)). Het fenotype van een cel met één gemuteerde en één wildtype operatormutatieplaats is dat LacZ en LacY worden geproduceerd, zelfs bij afwezigheid van de inducer IPTG; omdat de beschadigde operatormutatieplaats geen binding van de repressor mogelijk maakt die de transcriptie van de structurele genen remt. De mutatie van de operator is dominant. Wanneer de plaats van de operator waar de repressor zich moet binden door mutatie is beschadigd, maakt de aanwezigheid van een tweede functionele plaats in dezelfde cel geen verschil voor de expressie van de genen die door de gemuteerde plaats worden gecontroleerd.
Een meer verfijnde versie van dit experiment maakt gebruik van gemerkte operons om de twee kopieën van de lac-genen van elkaar te onderscheiden en laat zien dat het ongereguleerde structurele gen (of de ongereguleerde structurele genen) degene (of de genen) is (zijn) die naast de gemuteerde operator ligt (paneel (g)). Stel bijvoorbeeld dat één exemplaar een mutatie heeft die lacZ inactiveert, zodat het alleen het LacY-eiwit kan produceren, terwijl het tweede exemplaar een mutatie heeft die lacY aantast en alleen LacZ kan produceren. In deze versie komt alleen het exemplaar van het lac-operon dat grenst aan de gemuteerde operator tot expressie zonder IPTG. We zeggen dat de mutatie van de operator cis-dominant is, dat wil zeggen dat hij dominant is ten opzichte van het wildtype, maar alleen van invloed is op het exemplaar van het operon dat er onmiddellijk aan grenst.
Deze verklaring is in belangrijke mate misleidend, omdat zij uitgaat van een beschrijving van het experiment en vervolgens de resultaten verklaart in termen van een model. Maar in feite is het vaak zo dat het model eerst komt, en dat een experiment speciaal wordt opgezet om het model te testen. Jacob en Monod stelden zich eerst voor dat er in het DNA een plaats moet zijn met de eigenschappen van de operator, en ontwierpen vervolgens hun complementatietests om dit aan te tonen.
De dominantie van operator mutanten suggereert ook een procedure om ze specifiek te selecteren. Als regulatiemutanten worden geselecteerd uit een cultuur van wild type met fenyl-Gal, zoals hierboven beschreven, zijn operator mutaties zeldzaam in vergelijking met repressormutanten, omdat de doelgrootte zo klein is. Maar als we in plaats daarvan beginnen met een stam die twee kopieën van de hele lac-regio draagt (die diploïd is voor lac), worden de repressormutaties (die nog steeds voorkomen) niet teruggevonden omdat complementatie door het tweede, wildtype lacI-gen een wildtype fenotype geeft. Daarentegen geeft mutatie van één kopie van de operator een mutant fenotype omdat het dominant is ten opzichte van de tweede, wildtype kopie.
Regulatie door cyclisch AMPEdit
De verklaring van diauxie hing af van de karakterisering van aanvullende mutaties die van invloed zijn op de lac genen, anders dan die verklaard worden door het klassieke model. Vervolgens werden twee andere genen, cya en crp, geïdentificeerd die zich ver van lac bevinden en die, wanneer gemuteerd, resulteren in een verminderd expressieniveau in aanwezigheid van IPTG en zelfs in stammen van de bacterie zonder de repressor of operator. De ontdekking van cAMP in E. coli leidde tot de demonstratie dat mutanten met een defect in het cya-gen, maar niet in het crp-gen, weer volledig actief kunnen worden door toevoeging van cAMP aan het medium.
Het cya-gen codeert voor adenylaatcyclase, dat cAMP produceert. In een cya-mutant maakt de afwezigheid van cAMP de expressie van de lacZYA-genen meer dan tien maal lager dan normaal. Toevoeging van cAMP corrigeert de lage expressie van lac die kenmerkend is voor cya-mutanten. Het tweede gen, crp, codeert voor een eiwit dat catabolite activator protein (CAP) of cAMP receptor protein (CRP) wordt genoemd.
De enzymen voor het metabolisme van lactose worden echter in kleine hoeveelheden gemaakt in aanwezigheid van zowel glucose als lactose (soms lekke expressie genoemd) doordat de LacI-repressor snel associeert/verwijdert van het DNA in plaats van er stevig aan te binden, waardoor RNAP tijd heeft om zich te binden en mRNA’s van lacZYA te transcriberen. Lek-expressie is nodig om het metabolisme van wat lactose mogelijk te maken nadat de glucosebron is uitgeput, maar voordat lac-expressie volledig is geactiveerd.
Samengevat:
- Wanneer lactose afwezig is, is er zeer weinig productie van het Lac-enzym (de operator heeft Lac-repressor aan zich gebonden).
- Wanneer lactose aanwezig is, maar een preferente koolstofbron (zoals glucose) is ook aanwezig, dan wordt een kleine hoeveelheid enzym geproduceerd (Lac repressor is niet gebonden aan de operator).
- Wanneer glucose afwezig is, bindt CAP-cAMP aan een specifieke DNA-locatie stroomopwaarts van de promotor en maakt een directe eiwit-eiwit interactie met RNAP die de binding van RNAP aan de promotor vergemakkelijkt.
De vertraging tussen de groeifasen weerspiegelt de tijd die nodig is om voldoende hoeveelheden lactosemetaboliserende enzymen te produceren. Eerst moet het CAP-reguleereiwit zich verzamelen op de lac-promotor, wat leidt tot een toename van de productie van lac-mRNA. Meer beschikbare kopieën van het lac-mRNA resulteert in de productie (zie vertaling) van aanzienlijk meer kopieën van LacZ (β-galactosidase, voor het metabolisme van lactose) en LacY (lactose-permease om lactose in de cel te transporteren). Na een vertraging die nodig is om het niveau van de lactose-metaboliserende enzymen te verhogen, komen de bacteriën in een nieuwe snelle fase van celgroei.
Twee raadsels van katabolieten-onderdrukking hebben betrekking op hoe cAMP-niveaus worden gekoppeld aan de aanwezigheid van glucose, en ten tweede, waarom de cellen zelfs maar de moeite zouden nemen. Nadat lactose is gesplitst vormt het in feite glucose en galactose (gemakkelijk omgezet in glucose). In metabolische termen is lactose net zo’n goede koolstof- en energiebron als glucose. Het cAMP-niveau is niet gerelateerd aan de intracellulaire glucoseconcentratie, maar aan de snelheid van het glucosetransport, dat de activiteit van adenylaat cyclase beïnvloedt. (Bovendien leidt glucosetransport ook tot directe remming van de lactose-permease). Over de reden waarom E. coli op deze manier werkt, kan men slechts speculeren. Alle enterische bacteriën fermenteren glucose, wat suggereert dat ze het vaak tegenkomen. Het is mogelijk dat een klein verschil in efficiëntie van transport of metabolisme van glucose versus lactose het voordelig maakt voor cellen om het lac operon op deze manier te reguleren.