Den experimentella mikroorganism som François Jacob och Jacques Monod använde var den vanliga laboratoriebakterien E. coli, men många av de grundläggande regleringskoncept som upptäcktes av Jacob och Monod är grundläggande för cellulär reglering i alla organismer. Den viktigaste idén är att proteiner inte syntetiseras när de inte behövs – E. coli sparar cellresurser och energi genom att inte tillverka de tre Lac-proteinerna när det inte finns något behov av att metabolisera laktos, t.ex. när andra sockerarter som glukos är tillgängliga. I följande avsnitt diskuteras hur E. coli styr vissa gener som svar på metaboliska behov.
Under andra världskriget testade Monod effekterna av kombinationer av sockerarter som näringskällor för E. coli och B. subtilis. Monod följde upp liknande studier som hade utförts av andra forskare med bakterier och jäst. Han fann att bakterier som odlades med två olika sockerarter ofta uppvisade två tillväxtfaser. Om till exempel både glukos och laktos tillfördes metaboliserades glukos först (tillväxtfas I, se figur 2) och därefter laktos (tillväxtfas II). Laktos metaboliserades inte under den första delen av den diauxiska tillväxtkurvan eftersom β-galaktosidas inte tillverkades när både glukos och laktos fanns i mediet. Monod gav detta fenomen namnet diauxie.
Monod riktade sedan sin uppmärksamhet på den induktion av β-galaktosidasbildning som skedde när laktos var det enda sockret i kulturmediet.
Klassificering av regulatoriska mutanterRedigera
Ett konceptuellt genombrott av Jacob och Monod var att inse skillnaden mellan regulatoriska substanser och platser där de verkar för att förändra genuttrycket. Jacob, som tidigare var soldat, använde sig av analogin med ett bombflygplan som släpper sin dödliga last när det tar emot en speciell radiosändning eller signal. Ett fungerande system kräver både en marksändare och en mottagare i flygplanet. Anta nu att den vanliga sändaren är trasig. Systemet kan fås att fungera genom att en andra fungerande sändare sätts in. Däremot, sade han, tänk dig ett bombflygplan med en defekt mottagare. Beteendet hos detta bombplan kan inte ändras genom att införa ett andra, fungerande flygplan.
För att analysera regulatoriska mutanter av lac-operonet utvecklade Jacob ett system genom vilket en andra kopia av lac-generna (lacI med sin promotor och lacZYA med promotor och operatör) kunde införas i en enda cell. En kultur av sådana bakterier, som är diploida för lac-generna men i övrigt normala, testas sedan med avseende på den regulatoriska fenotypen. I synnerhet bestäms om LacZ och LacY tillverkas även i avsaknad av IPTG (på grund av att den laktosrepressor som produceras av den muterade genen är icke-funktionell). Detta experiment, där gener eller genkluster testas parvis, kallas komplementeringstest.
Detta test illustreras i figuren (lacA är utelämnad för enkelhetens skull). Först visas vissa haploida tillstånd (dvs. cellen bär endast en enda kopia av lac-generna). Panel (a) visar repression, (b) visar induktion med IPTG, och (c) och (d) visar effekten av en mutation i lacI-genen respektive operatorn. I panel (e) visas komplementeringstestet för repressor. Om en kopia av lac-generna bär på en mutation i lacI, men den andra kopian är vildtyp för lacI, är den resulterande fenotypen normal – men lacZ uttrycks när den utsätts för inducerande IPTG. Mutationer som påverkar repressorn sägs vara recessiva i förhållande till vildtypen (och att vildtypen är dominant), och detta förklaras av att repressorn är ett litet protein som kan diffundera i cellen. Den kopia av lac-operonet som gränsar till den defekta lacI-genen stängs effektivt av genom det protein som produceras från den andra kopian av lacI.
Om samma experiment utförs med hjälp av en operatörsmutation erhålls ett annat resultat (panel (f)). Fenotypen hos en cell med en muterad och en vildtypen operatörsplats är att LacZ och LacY produceras även i avsaknad av induceraren IPTG, eftersom den skadade operatörsplatsen inte tillåter att repressorn binder sig för att hämma transkriptionen av de strukturella generna. Operatörsmutationen är dominant. När den operatörsplats där repressorn måste binda är skadad genom mutation, gör närvaron av en andra funktionell plats i samma cell ingen skillnad för uttrycket av gener som kontrolleras av den muterade platsen.
En mer sofistikerad version av detta experiment använder markerade operoner för att skilja mellan de två kopiorna av lac-gener och visar att den oreglerade strukturella genen (eller strukturgenerna) är den (de) som ligger bredvid den muterade operatören (panel (g)). Anta till exempel att den ena kopian är markerad med en mutation som inaktiverar lacZ så att den endast kan producera LacY-proteinet, medan den andra kopian bär på en mutation som påverkar lacY och endast kan producera LacZ. I denna version uttrycks endast den kopia av lac-operonet som gränsar till den muterade operatören utan IPTG. Vi säger att operatörsmutationen är cis-dominant, den är dominant i förhållande till vildtypen men påverkar endast den kopia av operonet som ligger i omedelbar anslutning till den.
Denna förklaring är missvisande i en viktig mening, eftersom den utgår från en beskrivning av försöket och sedan förklarar resultaten i termer av en modell. Men i själva verket är det ofta så att modellen kommer först, och ett experiment utformas specifikt för att testa modellen. Jacob och Monod föreställde sig först att det måste finnas en plats i DNA med operatörens egenskaper, och utformade sedan sina komplementeringstester för att visa detta.
Dominansen hos operatörsmutanter tyder också på ett förfarande för att välja ut dem specifikt. Om regulatoriska mutanter väljs ut från en kultur av vildtyp med hjälp av fenyl-Gal, enligt beskrivningen ovan, är operatormutationer sällsynta jämfört med repressormutanter eftersom målstorleken är så liten. Men om vi i stället börjar med en stam som bär på två kopior av hela lac-regionen (dvs. diploid för lac), återfinns inte repressormutationerna (som fortfarande förekommer) eftersom komplementering med den andra lacI-genen av vildtyp ger en fenotyp av vildtyp. Däremot ger mutation av en kopia av operatören en mutantfenotyp eftersom den är dominant i förhållande till den andra, vilda kopian.
Reglering genom cykliskt AMPEdit
Förklaringen av diauxie berodde på karakteriseringen av ytterligare mutationer som påverkar lac-generna, andra än de som förklaras av den klassiska modellen. Två andra gener, cya och crp, identifierades senare som kartlades långt från lac och som, när de muteras, resulterar i en minskad uttrycksnivå i närvaro av IPTG och även i bakteriestammar som saknar repressor eller operatör. Upptäckten av cAMP i E. coli ledde till att man visade att mutanter som är defekta i cya-genen men inte i crp-genen kunde återställas till full aktivitet genom tillsats av cAMP i mediet.
Cya-genen kodar för adenylatcyklas, som producerar cAMP. I en cya-mutant gör avsaknaden av cAMP att uttrycket av lacZYA-generna är mer än tio gånger lägre än normalt. Tillsats av cAMP korrigerar det låga Lac-uttrycket som är karakteristiskt för cya-mutanter. Den andra genen, crp, kodar för ett protein som kallas catabolite activator protein (CAP) eller cAMP-receptorprotein (CRP).
Hursomhelst tillverkas laktosmetabolismens enzymer i små mängder i närvaro av både glukos och laktos (ibland kallat läckande uttryck) på grund av att LacI-repressorn snabbt associerar/avskiljer sig från DNA:t i stället för att binda tätt till det, vilket kan ge RNAP tid att binda och transkribera mRNA:er av lacZYA. Läckande uttryck är nödvändigt för att möjliggöra metabolism av en del laktos efter att glukoskällan har förbrukats, men innan lac-uttrycket aktiveras fullt ut.
Sammanfattningsvis:
- När laktos saknas sker det mycket lite produktion av Lac-enzym (operatören har Lac-repressorn bunden till sig).
- När laktos är närvarande men en föredragen kolkälla (t.ex. glukos) också är närvarande produceras en liten mängd enzym (Lac-repressorn är inte bunden till operatören).
- När glukos saknas binder CAP-cAMP till en specifik DNA-plats uppströms promotorn och gör en direkt protein-proteininteraktion med RNAP som underlättar bindningen av RNAP till promotorn.
Den fördröjning som uppstår mellan tillväxtfaserna återspeglar den tid som behövs för att producera tillräckliga mängder laktosmetaboliserande enzymer. Först måste CAP-regulatorproteinet samlas på lac-promotorn, vilket resulterar i en ökning av produktionen av lac-mRNA. Fler tillgängliga kopior av lac-mRNA resulterar i produktion (se översättning) av betydligt fler kopior av LacZ (β-galaktosidas, för laktosmetabolism) och LacY (laktospermeas för att transportera laktos in i cellen). Efter en fördröjning som behövs för att öka nivån av de laktosmetaboliserande enzymerna går bakterierna in i en ny snabb fas av celltillväxt.
Två gåtor kring katabolitrepressaltionen gäller dels hur cAMP-nivåerna är kopplade till närvaron av glukos, dels varför cellerna överhuvudtaget ska bry sig om det. Efter att laktos klyvs bildar den faktiskt glukos och galaktos (som lätt omvandlas till glukos). I metaboliska termer är laktos en lika bra kol- och energikälla som glukos. CAMP-nivån är inte relaterad till den intracellulära glukoskoncentrationen utan till hastigheten på glukostransporten, som påverkar aktiviteten hos adenylatcyklas. (Dessutom leder glukostransporten också till en direkt hämning av laktospermeaset). När det gäller varför E. coli fungerar på detta sätt kan man bara spekulera. Alla tarmbakterier fermenterar glukos, vilket tyder på att de möter glukos ofta. Det är möjligt att en liten skillnad i effektivitet i transport eller metabolism av glukos kontra laktos gör det fördelaktigt för cellerna att reglera lac-operonet på detta sätt.