Der von François Jacob und Jacques Monod verwendete Versuchsmikroorganismus war das gewöhnliche Laborbakterium E. coli, aber viele der von Jacob und Monod entdeckten grundlegenden Regulierungskonzepte sind für die Zellregulierung in allen Organismen grundlegend. Der Schlüsselgedanke ist, dass Proteine nicht synthetisiert werden, wenn sie nicht benötigt werden – E. coli spart zelluläre Ressourcen und Energie, indem es die drei Lac-Proteine nicht herstellt, wenn keine Notwendigkeit besteht, Laktose zu verstoffwechseln, z. B. wenn andere Zucker wie Glukose verfügbar sind. Im folgenden Abschnitt wird erörtert, wie E. coli bestimmte Gene als Reaktion auf Stoffwechselbedürfnisse steuert.
Während des Zweiten Weltkriegs testete Monod die Auswirkungen von Zuckerkombinationen als Nährstoffquellen für E. coli und B. subtilis. Monod knüpfte damit an ähnliche Studien an, die andere Wissenschaftler mit Bakterien und Hefe durchgeführt hatten. Er stellte fest, dass Bakterien, die mit zwei verschiedenen Zuckern gezüchtet wurden, oft zwei Wachstumsphasen zeigten. Wurden beispielsweise sowohl Glukose als auch Laktose zugeführt, wurde zuerst die Glukose verstoffwechselt (Wachstumsphase I, siehe Abbildung 2) und dann die Laktose (Wachstumsphase II). Laktose wurde während des ersten Teils der diauxischen Wachstumskurve nicht verstoffwechselt, da β-Galaktosidase nicht gebildet wurde, wenn sowohl Glukose als auch Laktose im Medium vorhanden waren. Monod nannte dieses Phänomen Diauxie.
Monod konzentrierte seine Aufmerksamkeit dann auf die Induktion der Bildung von β-Galaktosidase, die auftrat, wenn Laktose der einzige Zucker im Kulturmedium war.
Klassifizierung von regulatorischen MutantenEdit
Ein konzeptioneller Durchbruch von Jacob und Monod war die Unterscheidung zwischen regulatorischen Substanzen und den Stellen, an denen sie die Genexpression verändern. Als ehemaliger Soldat benutzte Jacob die Analogie eines Bombers, der seine tödliche Fracht beim Empfang eines speziellen Funksignals freisetzt. Ein funktionierendes System erfordert sowohl einen Sender am Boden als auch einen Empfänger im Flugzeug. Nehmen wir nun an, dass der übliche Sender defekt ist. Dieses System kann durch die Einführung eines zweiten, funktionsfähigen Senders zum Laufen gebracht werden. Im Gegensatz dazu, sagte er, betrachte man einen Bomber mit einem defekten Empfänger. Das Verhalten dieses Bombers kann nicht durch die Einführung eines zweiten, funktionierenden Flugzeugs geändert werden.
Um regulatorische Mutanten des lac-Operons zu analysieren, entwickelte Jacob ein System, mit dem eine zweite Kopie der lac-Gene (lacI mit seinem Promotor und lacZYA mit Promotor und Operator) in eine einzige Zelle eingeführt werden kann. Eine Kultur solcher Bakterien, die für die lac-Gene diploid, ansonsten aber normal sind, wird dann auf den regulatorischen Phänotyp getestet. Insbesondere wird festgestellt, ob LacZ und LacY auch in Abwesenheit von IPTG gebildet werden (da der vom mutierten Gen produzierte Laktose-Repressor nicht funktionsfähig ist). Dieses Experiment, bei dem Gene oder Gencluster paarweise getestet werden, wird als Komplementationstest bezeichnet.
Dieser Test ist in der Abbildung dargestellt (lacA ist der Einfachheit halber weggelassen). Zunächst werden bestimmte haploide Zustände gezeigt (d.h. die Zelle trägt nur eine einzige Kopie der lac-Gene). Tafel (a) zeigt die Repression, (b) die Induktion durch IPTG, und (c) und (d) zeigen die Wirkung einer Mutation des lacI-Gens bzw. des Operators. In Tafel (e) ist der Komplementationstest für den Repressor dargestellt. Wenn eine Kopie der lac-Gene eine Mutation in lacI trägt, die zweite Kopie aber Wildtyp für lacI ist, ist der resultierende Phänotyp normal, aber lacZ wird exprimiert, wenn es dem Induktor IPTG ausgesetzt wird. Mutationen, die den Repressor betreffen, werden als rezessiv gegenüber dem Wildtyp bezeichnet (und der Wildtyp ist dominant), was sich dadurch erklärt, dass der Repressor ein kleines Protein ist, das in der Zelle diffundieren kann. Die Kopie des lac-Operons, die an das defekte lacI-Gen angrenzt, wird durch das von der zweiten lacI-Kopie produzierte Protein effektiv abgeschaltet.
Wird dasselbe Experiment mit einer Operatormutation durchgeführt, erhält man ein anderes Ergebnis (Tafel (f)). Der Phänotyp einer Zelle, die eine mutierte und eine Wildtyp-Operatorstelle trägt, besteht darin, dass LacZ und LacY auch in Abwesenheit des Induktors IPTG produziert werden, weil die beschädigte Operatorstelle die Bindung des Repressors zur Hemmung der Transkription der Strukturgene nicht zulässt. Die Operatormutation ist dominant. Wenn die Operatorstelle, an die der Repressor binden muss, durch eine Mutation geschädigt ist, macht das Vorhandensein einer zweiten funktionellen Stelle in derselben Zelle keinen Unterschied bei der Expression der Gene, die von der mutierten Stelle kontrolliert werden.
Eine anspruchsvollere Version dieses Experiments verwendet markierte Operons, um zwischen den beiden Kopien der lac-Gene zu unterscheiden und zu zeigen, dass das/die unregulierte(n) strukturelle(n) Gen(e) das/diejenige(n) ist/sind, das/die neben dem mutierten Operator liegt/liegen (Tafel (g)). Nehmen wir zum Beispiel an, dass eine Kopie durch eine Mutation gekennzeichnet ist, die lacZ inaktiviert, so dass sie nur das LacY-Protein produzieren kann, während die zweite Kopie eine Mutation trägt, die lacY betrifft und nur LacZ produzieren kann. In dieser Version wird nur die Kopie des lac-Operons, die dem mutierten Operator benachbart ist, ohne IPTG exprimiert. Wir sagen, dass die Operator-Mutation cis-dominant ist, d.h. sie ist dominant gegenüber dem Wildtyp, wirkt sich aber nur auf die unmittelbar benachbarte Kopie des Operons aus.
Diese Erklärung ist in einem wichtigen Punkt irreführend, denn sie geht von einer Beschreibung des Experiments aus und erklärt dann die Ergebnisse mit Hilfe eines Modells. Tatsächlich ist es aber oft so, dass das Modell an erster Stelle steht und ein Experiment speziell zur Überprüfung des Modells entworfen wird. Jacob und Monod stellten sich zunächst vor, dass es in der DNA eine Stelle mit den Eigenschaften des Operators geben muss, und entwarfen dann ihre Komplementationstests, um dies zu zeigen.
Die Dominanz von Operatormutanten legt auch ein Verfahren nahe, um sie gezielt auszuwählen. Wenn regulatorische Mutanten aus einer Wildtypkultur mit Phenyl-Gal selektiert werden, wie oben beschrieben, sind Operator-Mutationen im Vergleich zu Repressor-Mutanten selten, weil die Zielgröße so klein ist. Wenn wir jedoch mit einem Stamm beginnen, der zwei Kopien der gesamten lac-Region trägt (diploid für lac), werden die Repressormutationen (die immer noch auftreten) nicht wiedergefunden, da die Komplementierung durch das zweite lacI-Gen vom Wildtyp einen Wildtyp-Phänotyp verleiht. Im Gegensatz dazu führt die Mutation einer Kopie des Operators zu einem mutierten Phänotyp, weil sie gegenüber der zweiten Wildtyp-Kopie dominant ist.
Regulierung durch zyklisches AMPEdit
Die Erklärung der Diauxie hing von der Charakterisierung zusätzlicher Mutationen ab, die die lac-Gene betreffen und nicht durch das klassische Modell erklärt werden. In der Folge wurden zwei weitere Gene, cya und crp, identifiziert, die weit von lac entfernt liegen und deren Mutation zu einer verminderten Expression in Gegenwart von IPTG und sogar in Bakterienstämmen ohne Repressor oder Operator führt. Die Entdeckung von cAMP in E. coli führte zu dem Nachweis, dass Mutanten, bei denen das cya-Gen, nicht aber das crp-Gen defekt ist, durch Zugabe von cAMP zum Medium wieder zu voller Aktivität gebracht werden können.
Das cya-Gen kodiert für die Adenylatcyclase, die cAMP produziert. In einer cya-Mutante führt das Fehlen von cAMP dazu, dass die Expression der lacZYA-Gene mehr als zehnmal niedriger ist als normal. Die Zugabe von cAMP korrigiert die für cya-Mutanten charakteristische geringe Lac-Expression. Das zweite Gen, crp, kodiert ein Protein namens catabolite activator protein (CAP) oder cAMP receptor protein (CRP).
Die Enzyme des Laktosestoffwechsels werden jedoch in Anwesenheit von Glukose und Laktose nur in geringen Mengen gebildet (manchmal als Leaky Expression bezeichnet), da der LacI-Repressor schnell mit der DNA assoziiert/dissoziiert, anstatt sich fest an sie zu binden, was RNAP Zeit geben kann, mRNAs von lacZYA zu binden und zu transkribieren. Leaky Expression ist notwendig, um den Stoffwechsel von etwas Laktose zu ermöglichen, nachdem die Glukosequelle verbraucht ist, aber bevor die Lac-Expression vollständig aktiviert ist.
Zusammenfassend:
- Wenn Laktose fehlt, wird nur sehr wenig Lac-Enzym produziert (der Operator hat Lac-Repressor an sich gebunden).
- Wenn Laktose vorhanden ist, aber auch eine bevorzugte Kohlenstoffquelle (wie Glukose) vorhanden ist, wird eine kleine Menge Enzym produziert (Lac-Repressor ist nicht an den Operator gebunden).
- Wenn Glukose nicht vorhanden ist, bindet CAP-cAMP an eine spezifische DNA-Stelle stromaufwärts des Promotors und geht eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit RNAP ein, die die Bindung von RNAP an den Promotor erleichtert.
Die Verzögerung zwischen den Wachstumsphasen spiegelt die Zeit wider, die benötigt wird, um ausreichende Mengen an Laktose-metabolisierenden Enzymen zu produzieren. Zunächst muss sich das CAP-Regulationsprotein am lac-Promotor anlagern, was zu einem Anstieg der Produktion von lac-mRNA führt. Mehr verfügbare Kopien der lac-mRNA führen zur Produktion (siehe Übersetzung) von deutlich mehr Kopien von LacZ (β-Galaktosidase, für den Laktosestoffwechsel) und LacY (Laktosepermease zum Transport von Laktose in die Zelle). Nach einer Verzögerung, die notwendig ist, um den Spiegel der Laktose verstoffwechselnden Enzyme zu erhöhen, treten die Bakterien in eine neue schnelle Phase des Zellwachstums ein.
Zwei Rätsel der Katabolitenunterdrückung beziehen sich darauf, wie der cAMP-Spiegel an das Vorhandensein von Glukose gekoppelt ist, und zweitens, warum sich die Zellen überhaupt die Mühe machen sollten. Nachdem die Laktose gespalten wurde, bildet sie Glukose und Galaktose (die leicht in Glukose umgewandelt werden kann). Aus metabolischer Sicht ist Laktose eine ebenso gute Kohlenstoff- und Energiequelle wie Glukose. Der cAMP-Spiegel hängt nicht mit der intrazellulären Glukosekonzentration zusammen, sondern mit der Geschwindigkeit des Glukosetransports, der die Aktivität der Adenylatcyclase beeinflusst. (Darüber hinaus führt der Glukosetransport auch zu einer direkten Hemmung der Laktosepermease). Warum E. coli auf diese Weise arbeitet, darüber kann man nur spekulieren. Alle Darmbakterien fermentieren Glukose, was darauf hindeutet, dass sie häufig mit ihr in Berührung kommen. Es ist möglich, dass ein kleiner Unterschied in der Effizienz des Transports oder des Stoffwechsels von Glukose gegenüber Laktose es für die Zellen vorteilhaft macht, das lac-Operon auf diese Weise zu regulieren.