O microorganismo experimental usado por François Jacob e Jacques Monod foi a bactéria laboratorial comum, E. coli, mas muitos dos conceitos regulatórios básicos que foram descobertos por Jacob e Monod são fundamentais para a regulação celular em todos os organismos. A idéia chave é que as proteínas não são sintetizadas quando não são necessárias-E. coli conserva os recursos celulares e a energia ao não fazer as três proteínas Lac quando não há necessidade de metabolizar a lactose, como quando outros açúcares como a glicose estão disponíveis. A seção seguinte discute como E. coli controla certos genes em resposta às necessidades metabólicas.
Durante a Segunda Guerra Mundial, Monod estava testando os efeitos de combinações de açúcares como fontes nutrientes para E. coli e B. subtilis. Monod estava seguindo estudos similares que tinham sido conduzidos por outros cientistas com bactérias e leveduras. Ele descobriu que as bactérias cultivadas com dois açúcares diferentes frequentemente apresentavam duas fases de crescimento. Por exemplo, se a glicose e a lactose foram ambas fornecidas, a glicose foi metabolizada primeiro (fase de crescimento I, ver Figura 2) e depois a lactose (fase de crescimento II). A lactose não foi metabolizada durante a primeira parte da curva de crescimento diauxico porque a β-galactosidase não foi feita quando tanto a glicose como a lactose estavam presentes no meio. Monod chamou este fenômeno de diauxie.
Monod então concentrou sua atenção na indução da formação da β-galactosidase que ocorreu quando a lactose era o único açúcar no meio de cultura.
Classificação dos mutantes regulatóriosEditar
Um avanço conceitual de Jacob e Monod foi reconhecer a distinção entre substâncias regulatórias e locais onde elas atuam para mudar a expressão gênica. Um ex-soldado, Jacob usou a analogia de um bombardeiro que liberaria sua carga letal ao receber uma transmissão ou sinal de rádio especial. Um sistema de trabalho requer tanto um transmissor em terra quanto um receptor no avião. Agora, suponha que o transmissor habitual esteja quebrado. Este sistema pode ser feito para funcionar através da introdução de um segundo transmissor, funcional. Em contraste, ele disse, considere um bombardeiro com um receptor defeituoso. O comportamento deste bombardeiro não pode ser alterado pela introdução de um segundo, avião funcional.
Para analisar os mutantes reguladores do operon lac, Jacob desenvolveu um sistema pelo qual uma segunda cópia dos genes lac (lacI com seu promotor, e lacZYA com promotor e operador) poderia ser introduzida em uma única célula. Uma cultura de tais bactérias, que são diplóides para os genes da laca, mas de outra forma normais, é então testada para o fenótipo regulador. Em particular, é determinado se LacZ e LacY são feitos mesmo na ausência do IPTG (devido ao repressor de lactose produzido pelo gene mutante ser não funcional). Este experimento, no qual genes ou grupos de genes são testados em pares, é chamado de teste de complementação.
Este teste é ilustrado na figura (lacA é omitido por simplicidade). Primeiro, certos estados haplóides são mostrados (ou seja, a célula carrega apenas uma única cópia dos genes lacA). O painel (a) mostra repressão, (b) mostra indução por IPTG, e (c) e (d) mostra o efeito de uma mutação para o gene lacI ou para o operador, respectivamente. No painel (e) é mostrado o teste de complementação para repressor. Se uma cópia dos genes lacI carrega uma mutação no lacI, mas a segunda cópia é do tipo selvagem para lacI, o fenótipo resultante é normal – mas lacZ é expresso quando exposto ao indutor IPTG. Diz-se que as mutações que afectam o repressor são recessivas ao tipo selvagem (e esse tipo selvagem é dominante), e isto é explicado pelo facto de o repressor ser uma pequena proteína que se pode difundir na célula. A cópia do operon lac adjacente ao gene lacI defeituoso é efetivamente fechada pela proteína produzida a partir da segunda cópia do lacI.
Se o mesmo experimento é realizado usando uma mutação do operador, um resultado diferente é obtido (painel (f)). O fenótipo de uma célula portadora de um mutante e de um operador tipo selvagem é que LacZ e LacY são produzidos mesmo na ausência do indutor IPTG; porque o local do operador danificado, não permite a ligação do repressor para inibir a transcrição dos genes estruturais. A mutação do operador é dominante. Quando o local do operador onde o repressor deve ligar-se é danificado pela mutação, a presença de um segundo local funcional na mesma célula não faz diferença na expressão dos genes controlados pelo local mutante.
Uma versão mais sofisticada deste experimento usa óperos marcados para distinguir entre as duas cópias dos genes lac e mostrar que o(s) gene(s) estrutural(is) não regulado(s) é(são) o(s) próximo(s) do operador mutante (painel (g). Por exemplo, suponha que uma cópia esteja marcada por uma mutação inactivando o LacZ para que ele só possa produzir a proteína LacY, enquanto que a segunda cópia carrega uma mutação que afecta o LacY e só pode produzir LacZ. Nesta versão, apenas a cópia do operon lac que está adjacente ao operador mutante é expressa sem IPTG. Dizemos que a mutação do operador é cis-dominante, é dominante ao tipo selvagem mas afeta apenas a cópia do ópero que é imediatamente adjacente a ele.
Esta explicação é enganosa num sentido importante, porque procede de uma descrição da experiência e depois explica os resultados em termos de um modelo. Mas, na verdade, muitas vezes é verdade que o modelo vem primeiro, e um experimento é feito especificamente para testar o modelo. Jacob e Monod primeiro imaginaram que deve haver um local no DNA com as propriedades do operador, e depois desenharam seus testes de complementação para mostrar isso.
O domínio dos mutantes do operador também sugere um procedimento para selecioná-los especificamente. Se os mutantes reguladores são selecionados a partir de uma cultura de tipo selvagem usando fenil-Gal, como descrito acima, as mutações de operador são raras em comparação com os mutantes repressores porque o tamanho do alvo é tão pequeno. Mas se em vez disso começarmos com uma linhagem que carrega duas cópias de toda a região lac (que é diploide para lac), as mutações repressoras (que ainda ocorrem) não são recuperadas porque a complementação pelo segundo gene de tipo selvagem lacI confere um fenótipo de tipo selvagem. Em contraste, a mutação de uma cópia do operador confere um fenótipo mutante porque é dominante na segunda cópia, wild type copy.
Regulação por AMPEdit cíclico
Explicação do diauxie dependia da caracterização de mutações adicionais que afetavam os genes da lac, além daquelas explicadas pelo modelo clássico. Dois outros genes, cya e crp, foram posteriormente identificados que mapeados longe da lac, e que, quando mutados, resultam em uma diminuição do nível de expressão na presença de IPTG e mesmo em cepas da bactéria sem o repressor ou operador. A descoberta do AMPc em E. coli levou à demonstração de que mutantes defeituosos do gene cya mas não do gene crp poderiam ser restaurados à plena atividade pela adição do AMPc ao meio.
O gene cya codifica adenilato ciclase, que produz o AMPc. Em uma cya mutante, a ausência do cAMP torna a expressão dos genes lacZYA mais de dez vezes menor que o normal. A adição de cAMP corrige a baixa expressão lac característica dos cya mutantes. O segundo gene, crp, codifica uma proteína chamada proteína ativadora catabolita (CAP) ou proteína receptora de cAMP (CRP).
No entanto, as enzimas do metabolismo da lactose são feitas em pequenas quantidades na presença de glicose e lactose (às vezes chamada de expressão vazada) devido ao fato do repressor LacI se associar/dissociar rapidamente do DNA ao invés de se ligar firmemente a ele, o que pode dar tempo para que o RNAP se ligue e transcreva mRNAs de lacZYA. A expressão vazada é necessária para permitir o metabolismo de alguma lactose depois que a fonte de glicose é gasta, mas antes que a expressão da laceração seja totalmente ativada.
Em resumo:
- Quando a lactose está ausente, há muito pouca produção de enzimas Lac (o operador tem o repressor Lac vinculado a ela).
- Quando a lactose está presente mas uma fonte de carbono preferencial (como a glicose) também está presente, então uma pequena quantidade de enzima é produzida (o repressor de Lac não está ligado ao operador).
- Quando a glicose está ausente, o CAP-cAMP liga-se a um local de DNA específico a montante do promotor e faz uma interacção directa proteína-proteína com o RNAP que facilita a ligação do RNAP ao promotor.
O atraso entre as fases de crescimento reflecte o tempo necessário para produzir quantidades suficientes de enzimas metabolizadoras da lactose. Primeiro, a proteína reguladora do CAP tem que ser montada no promotor da laceração, resultando num aumento da produção de mRNA da laceração. Mais cópias disponíveis do mRNA lac resulta na produção (ver tradução) de significativamente mais cópias de LacZ (β-galactosidase, para o metabolismo da lactose) e LacY (permease da lactose para transportar a lactose para a célula). Após um atraso necessário para aumentar o nível das enzimas metabolizadoras da lactose, as bactérias entram em uma nova fase rápida de crescimento celular.
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Dois puzzles de repressão catabolita relacionam-se com a forma como os níveis de AMPc são acoplados à presença de glicose, e, em segundo lugar, porque as células devem até mesmo se preocupar. Após a lactose ser clivada, ela realmente forma glicose e galactose (facilmente convertida em glicose). Em termos metabólicos, a lactose é uma fonte tão boa de carbono e energia quanto a glicose. O nível de AMPc não está relacionado com a concentração de glicose intracelular, mas sim com a taxa de transporte de glicose, que influencia a atividade da adenilato ciclase. (Além disso, o transporte de glicose também leva à inibição direta da permease da lactose). Quanto ao porquê da E. coli funcionar desta forma, só se pode especular. Todas as bactérias entéricas fermentam a glicose, o que sugere que a encontram frequentemente. É possível que uma pequena diferença na eficiência de transporte ou metabolismo da glicose v. lactose torne vantajoso para as células regularem o operon lacrimogêneo desta forma.