Den eksperimentelle mikroorganisme, som François Jacob og Jacques Monod brugte, var den almindelige laboratoriebakterie E. coli, men mange af de grundlæggende reguleringsbegreber, som blev opdaget af Jacob og Monod, er grundlæggende for cellulær regulering i alle organismer. Den centrale idé er, at proteiner ikke syntetiseres, når der ikke er brug for dem – E. coli sparer på cellens ressourcer og energi ved ikke at fremstille de tre Lac-proteiner, når der ikke er behov for at metabolisere laktose, f.eks. når der er andre sukkerarter som glukose til rådighed. I det følgende afsnit diskuteres det, hvordan E. coli styrer visse gener som reaktion på metaboliske behov.
Under anden verdenskrig testede Monod virkningerne af kombinationer af sukkerstoffer som næringskilder for E. coli og B. subtilis. Monod fulgte op på lignende undersøgelser, der var blevet udført af andre forskere med bakterier og gær. Han fandt ud af, at bakterier, der blev dyrket med to forskellige sukkerarter, ofte viste to vækstfaser. Hvis der f.eks. både blev tilført glukose og laktose, blev glukose først omsat (vækstfase I, se figur 2) og derefter laktose (vækstfase II). Laktose blev ikke omsat i den første del af den diauxiske vækstkurve, fordi der ikke blev fremstillet β-galaktosidase, når både glukose og laktose var til stede i mediet. Monod kaldte dette fænomen for diauxie.
Monod fokuserede derefter sin opmærksomhed på den induktion af β-galactosidase-dannelse, der opstod, når lactose var det eneste sukkerstof i kulturmediet.
Klassificering af regulatoriske mutanterRediger
Et begrebsmæssigt gennembrud af Jacob og Monod var at erkende forskellen mellem regulatoriske stoffer og steder, hvor de virker for at ændre genekspressionen. Jacob, der var tidligere soldat, brugte analogien med et bombefly, der ville frigive sin dødbringende last ved modtagelse af en særlig radiotransmission eller et særligt signal. Et fungerende system kræver både en jordsender og en modtager i flyet. Lad os nu antage, at den sædvanlige sender er i stykker. Dette system kan bringes til at fungere ved at indsætte en anden, funktionsdygtig sender. I modsætning hertil, sagde han, tænk på et bombefly med en defekt modtager. Denne bombemaskines adfærd kan ikke ændres ved at indføre et andet, funktionelt fly.”
For at analysere regulerende mutanter af lac-operonet udviklede Jacob et system, hvormed en anden kopi af lac-generne (lacI med sin promotor og lacZYA med promotor og operatør) kunne indføres i en enkelt celle. En kultur af sådanne bakterier, som er diploide for lac-generne, men ellers normale, testes derefter for den regulatoriske fænotype. Det bestemmes især, om LacZ og LacY fremstilles selv i fravær af IPTG (fordi den laktose-repressor, der produceres af det mutante gen, ikke er funktionel). Dette forsøg, hvor gener eller genklynger testes parvis, kaldes en komplementeringstest.
Denne test er illustreret i figuren (lacA er udeladt af hensyn til enkelheden). Først vises visse haploide tilstande (dvs. at cellen kun bærer en enkelt kopi af lac-generne). Panel (a) viser repression, (b) viser induktion med IPTG, og (c) og (d) viser virkningen af en mutation i henholdsvis lacI-genet eller operatoren. I panel (e) er komplementeringstesten for repressor vist. Hvis den ene kopi af lac-generne bærer en mutation i lacI, men den anden kopi er vild type for lacI, er den resulterende fænotype normal – men lacZ udtrykkes, når den udsættes for inducerende IPTG. Mutationer, der påvirker repressoren, siges at være recessive i forhold til vildtypen (og at vildtypen er dominerende), og dette forklares ved, at repressoren er et lille protein, der kan diffundere i cellen. Den kopi af lac-operonet, der støder op til det defekte lacI-gen, lukkes effektivt af for det protein, der produceres fra den anden kopi af lacI.
Hvis det samme forsøg udføres med en operatormutation, fås et andet resultat (panel (f)). Fænotypen for en celle med et mutant- og et wild type operatørsted er, at LacZ og LacY produceres selv i fravær af induceren IPTG; fordi det beskadigede operatørsted ikke tillader binding af repressoren til at hæmme transkriptionen af de strukturelle gener. Operatormutationen er dominerende. Når operatorstedet, hvor repressoren skal binde, er beskadiget ved mutation, gør tilstedeværelsen af et andet funktionelt sted i den samme celle ingen forskel for ekspressionen af gener, der kontrolleres af det muterede sted.
En mere sofistikeret version af dette eksperiment anvender markerede operoner til at skelne mellem de to kopier af lac-generne og viser, at det eller de uregulerede strukturelle gener er dem, der ligger ved siden af den muterede operator (panel (g)). Antag f.eks. at den ene kopi er markeret med en mutation, der inaktiverer lacZ, således at den kun kan producere LacY-proteinet, mens den anden kopi bærer en mutation, der påvirker lacY, og kun kan producere LacZ. I denne version er det kun den kopi af lac-operonet, der støder op til den muterede operator, der udtrykkes uden IPTG. Vi siger, at operatormutationen er cis-dominant, den er dominerende i forhold til wild type, men påvirker kun den kopi af operonet, der er umiddelbart tilstødende til den.
Denne forklaring er misvisende i en vigtig forstand, fordi den går ud fra en beskrivelse af eksperimentet og derefter forklarer resultaterne ud fra en model. Men i virkeligheden er det ofte rigtigt, at modellen kommer først, og at et eksperiment er udformet specifikt til at teste modellen. Jacob og Monod forestillede sig først, at der må være et sted i DNA med operatorens egenskaber, og udformede derefter deres komplementeringstest for at vise dette.
Dominansen af operatormutanter tyder også på en procedure til at udvælge dem specifikt. Hvis regulatoriske mutanter udvælges fra en kultur af vild type ved hjælp af phenyl-Gal, som beskrevet ovenfor, er operatormutationer sjældne sammenlignet med repressormutanter, fordi målstørrelsen er så lille. Men hvis vi i stedet starter med en stamme, der bærer to kopier af hele lac-regionen (dvs. diploid for lac), genfindes repressormutationerne (som stadig forekommer) ikke, fordi komplementering med det andet lacI-gen af vildtypen giver en vildtype-fænotype. I modsætning hertil giver mutation af den ene kopi af operatoren en mutantfænotype, fordi den er dominerende i forhold til den anden, vildtype-kopi.
Regulering ved cyklisk AMPEdit
Forklaringen af diauxie afhænger af karakteriseringen af yderligere mutationer, der påvirker lac-generne, ud over dem, der forklares af den klassiske model. To andre gener, cya og crp, blev efterfølgende identificeret, som er kortlagt langt fra lac, og som, når de er muteret, resulterer i et nedsat ekspressionsniveau i tilstedeværelse af IPTG og selv i bakteriestammer, der mangler repressoren eller operatoren. Opdagelsen af cAMP i E. coli førte til påvisning af, at mutanter med defekt cya-genet, men ikke crp-genet, kunne genoprettes til fuld aktivitet ved tilsætning af cAMP til mediet.
Cya-genet koder for adenylatcyclase, som producerer cAMP. I en cya-mutant gør fraværet af cAMP, at ekspressionen af lacZYA-generne er mere end ti gange lavere end normalt. Tilføjelse af cAMP korrigerer den lave Lac-ekspression, der er karakteristisk for cya-mutanter. Det andet gen, crp, koder for et protein kaldet catabolite activator protein (CAP) eller cAMP-receptorprotein (CRP).
Men laktosemetabolismeenzymerne fremstilles i små mængder i tilstedeværelse af både glukose og laktose (undertiden kaldet leaky expression) på grund af det faktum, at LacI-repressoren hurtigt associerer/dissocierer fra DNA’et i stedet for at binde tæt til det, hvilket kan give RNAP tid til at binde og transskribere mRNA’er af lacZYA. Lækkelig ekspression er nødvendig for at tillade metabolisme af noget laktose, efter at glukosekilden er brugt op, men før lac-ekspressionen er fuldt aktiveret.
Sammenfattende:
- Når laktose er fraværende, er der meget lidt Lac-enzymproduktion (operatoren har Lac-repressoren bundet til sig).
- Når laktose er til stede, men en foretrukken kulstofkilde (som f.eks. glukose) også er til stede, produceres der en lille mængde enzym (Lac-repressoren er ikke bundet til operatoren).
- Når glukose er fraværende, binder CAP-cAMP sig til et specifikt DNA-sted opstrøms for promotoren og foretager en direkte protein-protein-interaktion med RNAP, der letter bindingen af RNAP til promotoren.
Den forsinkelse mellem vækstfaser afspejler den tid, der er nødvendig for at producere tilstrækkelige mængder af laktose-metaboliserende enzymer. Først skal det CAP-regulerende protein samles på lac-promotoren, hvilket resulterer i en stigning i produktionen af lac-mRNA. Flere tilgængelige kopier af lac mRNA resulterer i produktion (se oversættelse) af betydeligt flere kopier af LacZ (β-galactosidase, til laktosemetabolisme) og LacY (laktosepermease til transport af laktose ind i cellen). Efter en forsinkelse, der er nødvendig for at øge niveauet af de laktoseomsættende enzymer, går bakterierne ind i en ny hurtig fase af cellevækst.
To gåder om katabolitrepression vedrører dels, hvordan cAMP-niveauet er koblet til tilstedeværelsen af glukose, dels hvorfor cellerne overhovedet skulle gide det. Efter at laktose er blevet spaltet, danner den faktisk glukose og galaktose (som let omdannes til glukose). I metabolisk henseende er laktose en lige så god kulstof- og energikilde som glukose. cAMP-niveauet er ikke relateret til den intracellulære glukosekoncentration, men til hastigheden af glukosetransporten, som påvirker aktiviteten af adenylatcyclase. (Desuden fører glukosetransport også til direkte hæmning af laktosepermease). Med hensyn til hvorfor E. coli fungerer på denne måde, kan man kun spekulere. Alle tarmbakterier fermenterer glukose, hvilket tyder på, at de støder på det ofte. Det er muligt, at en lille forskel i effektiviteten af transport eller metabolisme af glukose vs. laktose gør det fordelagtigt for cellerne at regulere lac-operonet på denne måde.