La biogenesi mitocondriale e l’iperattivazione metabolica limitano l’applicazione del test MTT nella stima dell’inibizione della crescita indotta dalle radiazioni

I cambiamenti nella vitalità metabolica indotta dalle radiazioni non sono correlati all’inibizione della crescita

Studiando l’inibizione della crescita indotta dalle radiazioni in varie linee cellulari usando il test MTT e contando il numero di cellule, abbiamo scoperto che i risultati ottenuti dai saggi basati sulla vitalità metabolica non sono correlati al numero effettivo di cellule in diversi punti temporali dopo l’esposizione alle radiazioni. Dal momento che il test MTT è ampiamente utilizzato in base al fatto che rappresenta veramente il numero di cellule vitali in qualsiasi campione dato2,3,4. Abbiamo esaminato questo test confrontando i valori MTT con il numero di cellule. Le cellule in crescita esponenziale sono state esposte a radiazioni ionizzanti per analizzare l’inibizione della crescita e la vitalità metabolica enumerando il numero di cellule e la riduzione del sale di tetrzolio a formazan (saggio MTT classico; qui usato come indice MTT), rispettivamente. In primo luogo, le cellule sono state esposte a diverse dosi di radiazioni ionizzanti (2, 3, 5 e 7 Gy) per osservare i cambiamenti dipendenti dalla dose di radiazione e la correlazione tra numero di cellule e vitalità metabolica. La quantità di formazan formata (cioè l’indice MTT) a 48 ore dopo l’irradiazione in tutte e tre le linee cellulari (A549, MDA-MB-231 e HeLa) ha mostrato dal 20 al 35% di riduzione (a 5 Gy e 7 Gy; Fig. 1Ai a Ci) rispetto alle cellule non irradiate, mentre la diminuzione del numero di cellule era nell’ordine del 70-90% (Fig. 1Aii a Cii), mentre il numero di cellule è stato ridotto dal 70 al 90% (Fig. 1Aii a Cii), indicando chiaramente una mancanza di correlazione tra la vitalità metabolica (indice MTT) e inibizione della crescita (numero di cellule) a tutte le dosi di radiazione; i due parametri di risposta alle radiazioni analizzati.

Inoltre, per esaminare la generalità di questa osservazione, abbiamo esaminato la relazione tra i cambiamenti nel numero di cellule (inibizione della crescita) e l’indice MTT (vitalità metabolica) in 7 linee cellulari non tumorogene e tumorogene (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 e MDA-MB-231) ad una singola dose (5 Gy), che ha indotto quasi il 50% di inibizione della crescita nelle tre cellule testate (Fig. 1 supplementare). A 24 ore dopo l’irradiazione, tutte le linee cellulari valutate hanno mostrato o uguali al controllo o un aumento del valore dell’indice MTT (Fig. 1Ai a Gi), tranne Raw 264.7 (Fig. 1Bi), che è relativamente sensibile alle radiazioni. D’altra parte, una diminuzione significativa del numero di cellule è stata notata in queste condizioni (Fig. 1Aii a Gii). A 48 ore dall’irradiazione, il numero di cellule era significativamente inferiore, dal 43% (MDA-MB-231, Fig. 1Gii) al 76% (Raw 264.7, Fig. 1Bii) rispetto al controllo, mentre i valori dell’indice MTT mostravano rispettivamente solo una riduzione dal 10% al 37%, con il massimo nella linea cellulare Raw264.7 (Fig. 1Bi). Quando i valori dell’indice MTT (Δ OD) sono stati normalizzati con il numero di cellule corrispondente, hanno mostrato da 1,4 a 3 volte (in diverse linee cellulari) una maggiore vitalità metabolica per cellula (informazioni derivate) a 24 e 48 ore, che si è ulteriormente ridotta a 48 ore nella maggior parte delle linee cellulari tranne Raw264.7, NIH/3T3 e cellule HeLa, ma rimane significativamente superiore al rispettivo controllo (Fig. 1Aiii a Giii). Queste osservazioni dimostrano chiaramente che il numero di cellule, che è la vera misura dell’inibizione della crescita indotta dalle radiazioni e/o della citotossicità, non si correla con il test ad alta produttività basato sulla vitalità metabolica (MTT), ampiamente utilizzato per la valutazione rapida della risposta alle radiazioni, che sembra essere dovuto alla vitalità metabolica potenziata indotta dalle radiazioni (Fig. 1Aiii a Giii) delle cellule esposte.

L’esposizione alle radiazioni aumenta la vitalità metabolica aumentando la massa mitocondriale

L’aumento della vitalità metabolica nelle cellule esposte alle radiazioni può derivare da mitocondri iperattivi o da un aumento della massa mitocondriale perché la conversione di MTT in formazan avviene principalmente nei mitocondri7,8,9,10. Le radiazioni ionizzanti sono note per indurre la massa e la funzione mitocondriale nelle cellule esposte20,21. Pertanto, abbiamo esaminato se l’aumento della massa mitocondriale è responsabile dell’aumento dell’indice MTT nelle cellule esposte alle radiazioni utilizzando la citometria a flusso. In linea con le osservazioni precedenti abbiamo trovato che la massa mitocondriale media per cella è stata significativamente aumentata di quasi 1,4 volte in MCF-7 (minimo, Fig. 2Fi) a 4 volte in Raw 264.7 (massimo, Fig. 2Bi) a 24 e 48 ore dopo l’esposizione alle radiazioni (Fig. 2Ai a Gi). Contemporaneamente nelle cellule irradiate è stata osservata anche una maggiore produzione di formazan per cellula nei rispettivi punti temporali, quantificata in condizioni sperimentali simili (Fig. 2Aii a Gii). Le immagini microscopiche a 24 ore dopo l’esposizione alle radiazioni mostrano anche un deposito di formazan visibilmente aumentato nelle cellule irradiate rispetto al loro controllo (Fig. 2Aiii a Giii). I corpi contenenti formazan (mitocondri) nelle cellule di controllo sono di colore meno intenso, scarsamente e uniformemente distribuiti nel citoplasma, mentre nelle cellule esposte alle radiazioni erano di colore scuro e raggruppati nella regione perinucleare (Fig. 2Aiii a Giii). Queste immagini microscopiche forniscono una prova visiva e di supporto per l’indice MTT più alto o una maggiore vitalità metabolica per cella nelle cellule irradiate. Inoltre, convalida come un numero ridotto di cellule sopravvissute irradiate può produrre una quantità molto più alta di formazan (densità di colore) per cella rispetto alle rispettive cellule di controllo non trattate, con conseguente falsa interpretazione dei dati.

La radiazione aumenta la vitalità metabolica inducendo la biogenesi mitocondriale

I mitocondri sono il sito principale dove MTT viene ridotto a Formazan7,8,9,10, quindi l’aumento della massa mitocondriale può aumentare la vitalità metabolica. L’aumento della massa mitocondriale nelle cellule irradiate potrebbe essere ottenuto per due motivi: primo, le radiazioni ionizzanti inducono il blocco G2/M22,23 le cellule arrestate in fase G2 avranno un numero maggiore di mitocondri22,23,24 che possono ridurre più MTT a formazan nelle cellule irradiate. In secondo luogo, le radiazioni ionizzanti sono note per indurre la biogenesi mitocondriale20,21, con conseguente aumento della massa mitocondriale. Per verificare se l’arresto G2/M indotto dalle radiazioni o la biogenesi mitocondriale o entrambi sono responsabili dell’aumento della massa mitocondriale per cellula nelle cellule irradiate, abbiamo esaminato entrambe le ipotesi in sequenza. Dal momento che le radiazioni inducono un aumento della massa mitocondriale (Fig. 2Ai a Gi) è stato osservato in tutte le linee cellulari, solo le cellule HeLa e MDA-MB-231 sono state selezionate a caso per capire i meccanismi alla base delle radiazioni indotte da una maggiore vitalità metabolica.

La distribuzione del ciclo cellulare è stata eseguita a 24 e 48 ore dopo la radiazione. A 24 ore, il 17 e il 6% di popolazioni di cellule in eccesso sono state trovate nella frazione G2/M del ciclo cellulare nelle cellule HeLa e MDA-MB-231 rispettivamente. Tuttavia il blocco è completamente rilasciato a 48 ore (Fig. 3A), suggerendo che l’arresto del ciclo cellulare indotto dalle radiazioni può contribuire in parte all’aumento della massa mitocondriale a 24 ore ma non a 48 ore. È anche importante notare che quasi il 17% di aumento del numero di cellule in fase G2/M non può portare circa 1,9 volte (che è il 90% alto) cambiamento nella massa mitocondriale e 1,5 volte cambiamento nella riduzione MTT a formazan a 24 ore in cellule HeLa (Fig. 2Di e Dii). Anche se il blocco del ciclo cellulare è stato completamente rilasciato a 48 ore, tuttavia la massa mitocondriale e la maggiore vitalità metabolica sono rimaste significativamente più alte dei rispettivi controlli. Queste osservazioni, non supportano la proposizione che le radiazioni indotte maggiore vitalità metabolica è a causa di arresto del ciclo cellulare mediato maggiore massa mitocondriale come riportato in precedenza in caso di trattamento composti polifenolici 18,25.

Inoltre, per verificare l’ipotesi che l’attività ipermetabolica indotta dalle radiazioni, che si correla con una maggiore massa mitocondriale nelle cellule esposte (Fig. 2Ai a Gi), sia dovuta alla biogenesi mitocondriale indotta dalle radiazioni, abbiamo analizzato il numero di copie di mtDNA nelle cellule di controllo ed esposte alle radiazioni. Il numero di copie del gene Leu t-RNA è stato misurato per il numero di copie di mtDNA codificate dal genoma mitocondriale e normalizzato con la pol-gamma nucleare, usando il metodo PCR semiquantitativo. Sia HeLa che MDA-MB-231cellule hanno mostrato il 18% e il 31% di aumento del numero di copie di mtDNA dopo 24 ore di esposizione alle radiazioni, che aumenta ulteriormente fino al 138% in HeLa e rimane del 21% in MDA-MB-231 rispetto alle cellule di controllo a 48 ore (Fig. 3B). Inoltre, abbiamo esaminato il livello di espressione dipendente dal tempo delle proteine PGC-1α (coattivatore 1-alfa del recettore gamma attivato dal perossisoma proliferatore) e TFAM (fattore di trascrizione mitocondriale A) usando il Western blot. Queste due proteine sono il regolatore chiave della biogenesi e del mantenimento mitocondriale nelle cellule26,27,28. È interessante notare che nelle cellule (HeLa e MDA-MB-231) esposte alle radiazioni è stato osservato un aumento dipendente dal tempo dell’espressione di PGC-1α e TFAM (Fig. 3C), che si correla con un aumento della massa mitocondriale a 24 ore (Fig. 2Di e Gi). Inoltre abbiamo controllato se l’aumento della massa mitocondriale è funzionale e ha aumentato l’espressione della proteina SDH-A, che è l’enzima riducente primario di MTT in Formazan7,8,9,10. I livelli proteici di SDH-A sono stati trovati aumentati dopo 8 e 24 ore di esposizione alle radiazioni (Fig. 3C), che si correla con un indice MTT migliorato o una maggiore vitalità metabolica nelle cellule HeLa e MDA-MB-231 (Figg. 1 e 2). I livelli di SDH-A sono stati trovati significativamente aumentati anche in altre linee cellulari (dati non mostrati). Inoltre, per convalidare l’ipotesi, la biogenesi mitocondriale indotta dalle radiazioni risulta in un aumento della vitalità metabolica; abbiamo inibito la biogenesi mitocondriale usando cloramfenicolo29,30. Quando MTT e la cinetica di crescita (Fig. 3E e F) sono stati eseguiti in cellule trattate con cloramfenicolo prima dell’esposizione alle radiazioni, hanno mostrato una formazione di Formazan significativamente bassa rispetto alle sole radiazioni (Fig. 3E), suggerendo così che la maggiore vitalità metabolica indotta dalle radiazioni è dovuta principalmente alla biogenesi mitocondriale. La differenza tra la curva di inibizione della crescita indotta dalle radiazioni ottenuta dal saggio MTT e il conteggio delle cellule rimane solo l’8% nelle cellule trattate con cloramfenicolo (Fig. 3E e F), che erano il 25% e il 33% nelle cellule HeLa e MDA-MB-231 (Fig. 1Di-ii e Gi-ii), rispettivamente. Questi risultati confermano l’ipotesi che le radiazioni indotte migliorano la massa mitocondriale e la vitalità metabolica deriva dalla biogenesi mitocondriale indotta dalle radiazioni fino a larga misura, che è regolata da PGC-1α e TFAM indotte dalle radiazioni.

Le radiazioni inducono l’iperattivazione dei mitocondri

Nei risultati precedenti, abbiamo osservato che le radiazioni ionizzanti inducono la massa mitocondriale nelle cellule, che sembra essere responsabile della maggiore vitalità metabolica (indice MTT) nelle cellule irradiate; tuttavia è noto che le radiazioni inducono anche l’iperattivazione dei singoli mitocondri nelle cellule irradiate31. Per determinare se l’aumento dell’indice MTT è stato osservato solo a causa dell’aumento della massa mitocondriale o anche dell’iperattivazione dei mitocondri indotta dalle radiazioni, abbiamo misurato il ΔΨm (potenziale di membrana mitocondriale, MMP) mediante microscopia a fluorescenza usando il TMRM. Le cellule irradiate (a 24 ore) hanno mostrato mitocondri punteggiati di rosso vivo, suggestivi di un alto ΔΨm, rispetto al controllo (Fig. 4A). Questo risultato è stato ulteriormente convalidato dalla stima quantitativa di ΔΨm usando DiOC6 tramite citometria a flusso. Le cellule HeLa hanno mostrato un aumento della MMP da 2,4 a 2,8 volte, ma le cellule MDA-MB-231 hanno mostrato cambiamenti di 1,3 volte nella MMP indotta dalle radiazioni in entrambi i punti temporali, rispettivamente (Fig. 4B). Questo alto potenziale di membrana mitocondriale si correla con un’alta formazione di formazan in ogni mitocondrio delle cellule irradiate (immagine inserita in Fig. 2Aiii), suggerendo un’iperattività del complesso II (SDH) (Fig. 2Aii a Gii), probabilmente dovuta all’aumento del ΔΨm indotto dalle radiazioni. Questa osservazione è in linea con i risultati precedenti in altri studi, che suggeriscono che il complesso II è più efficiente nello stabilire e mantenere il ΔΨm in condizioni di stress32,33. L’aumento del ΔΨm dovuto al complesso II iperattivo assicura una maggiore attività anche di altre deidrogenasi mitocondriali, che possono contribuire all’aumento della formazione di formazan oltre alla SDH.

L’ossidazione guidata dal sucinato attraverso il complesso-II (SDH) è stata trovata con il contributo significativo verso la generazione di ROS mitocondriale aumentata34. Pertanto, abbiamo analizzato il livello di superossido mitocondriale in cellule di controllo e irradiate per verificare il fatto che i mitocondri ipermetabolicamente attivi dovrebbero produrre più radicali superossidi. Le cellule colorate con MitoSox (indicatore ROS mitocondriale) sono state analizzate su citometro a flusso. Le cellule irradiate mostrano una fluorescenza MitoSox significativamente aumentata rispetto al loro rispettivo controllo. Entrambe le linee cellulari hanno mostrato un aumento di quasi 1,25 volte del ROS mitocondriale a 24 ore, tuttavia, è aumentato ulteriormente a 1,65 volte in HeLa e 1,5 volte in MDA-MB-231 a 48 ore dopo l’esposizione alle radiazioni (Fig. 4C). Poiché la deidrogenasi mitocondriale SDH è il principale contributore della riduzione di MTT7,8,9,10, questi risultati convalidano l’osservazione che l’aumento dei ROS è direttamente proporzionale alla maggiore attività SDH34. Questi risultati suggeriscono che la massa mitocondriale aumentata consiste di mitocondri funzionalmente iperattivi, riducendo una maggiore quantità di MTT in formazan per cella nei campioni irradiati.

Le radiazioni inducono l’accumulo di calcio nei mitocondri

Le radiazioni ionizzanti disturbano l’omeostasi del calcio cellulare portando a un maggiore rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (ER) al citoplasma, che viene poi tamponato dai mitocondri funzionali nella regione perinucleare delle cellule35,36. L’omeostasi del calcio alterata induce anche la produzione di ROS (specie reattive dell’ossigeno) e la biogenesi mitocondriale35,36,37.

Per indagare se l’aumento della vitalità metabolica osservato a 24 e 48 ore è dovuto all’aumento dei livelli di Ca2+ citoplasmatici e mitocondriali, è stato stimato il Ca2+ libero cellulare e mitocondriale. Le cellule di controllo e quelle trattate sono state colorate con Fluo-3AM (indicatore di Ca2+) e Rhod-2AM (indicatore specifico di Ca2+ mitocondriale)38 nei rispettivi momenti e analizzate al citometro a flusso. L’aumento significativo del livello di calcio è stato osservato nelle cellule irradiate, che è stato aumentato di quasi 1,4 volte (40%) in entrambe le linee cellulari (HeLa e MDA-MB-231) studiato, come suggerito da un aumento della fluorescenza Fluo-3 a 8 ore, che si riduce marginalmente a 24 ore (Fig. 5A). È interessante notare che è stato notato un aumento ancora maggiore del Ca2+ mitocondriale indotto dalle radiazioni (2,4 volte nella HeLa e 1,6 volte nella MDA-MB-231, Fig. 5B). Questa osservazione è stata ulteriormente verificata visualizzando le cellule colorate al microscopio a fluorescenza. Le cellule colorate con Mitotracker Red, Fluo-3AM e Rhod-2AM indipendentemente a 24 ore dopo il trattamento con radiazioni è stato osservato. Fluo-3AM e Rhod-2AM entrambi mostrano una forte fluorescenza perinucleare punteggiato con lo stesso modello come mostrato da mitotracker rosso in radiazioni esposte cellule corrispondenti (Fig. 5C), suggerendo che un aumento citoplasmatico Ca2 + è accumulato in mitocondri. Inoltre, i segnali specifici di Ca2+ dai mitocondri nelle cellule colorate con Rhod-2AM, convalidano questa osservazione. È interessante notare che le cellule MDA-MB-231 mostravano già un alto Ca2+ mitocondriale (colorazione Rhod-2-AM) e un raggruppamento mitocondriale perinucleare (colorazione Mitotracker Red) nelle cellule di controllo, che aumenta ulteriormente dopo l’irradiazione, questo potrebbe essere il motivo per cui questa cellula ha mostrato il minor aumento nella biogenesi mitocondriale indotta dalla radiazione e nella formazione di formazan, successivamente. Abbiamo dimostrato nel nostro studio precedente che le radiazioni causano l’accumulo di Ca2+ nei mitocondri portando a danni mitocondriali e mitofagia36. Mitocondri con alto Ca2+ e potenziato potenziale di membrana mitocondriale accumulare più A23187 e mostra più luminoso fluorescenza al microscopio su eccitazione UV. Tuttavia, permanentemente danneggiato mitocondri mostrano fluorescenza molto alta e appaiono come corpi rotondi all’interno della cella36. Per osservare l’accumulo di Ca2+ nei mitocondri in queste condizioni sperimentali, abbiamo colorato le cellule HeLa e MDA-MB-231 di controllo e irradiate a 24 ore dopo l’esposizione (Fig. 5C). Le cellule irradiate hanno anche mostrato un maggiore accumulo di corpi che indicano i mitocondri danneggiati indotti dalle radiazioni. Le cellule irradiate mostrano una maggiore fluorescenza Mitotracker Red, Fluo-3AM e Rhod-2AM nella regione perinucleare (Fig. 5C), dove i mitocondri formano una rete con il reticolo endoplasmatico (ER) e accumulano la maggior parte delle perdite di Ca2+ indotte dallo stress da ER e proteggono le cellule dalla morte39. Questa scoperta suggerisce che il Ca2+ rilasciato dai depositi dopo l’esposizione alle radiazioni si accumula principalmente nei mitocondri. È stato riportato in precedenza che un alto Ca2+ nella matrice mitocondriale aumenta l’attività SDH40. Pertanto, correliamo che il Ca2+ accumulato nei mitocondri ha aumentato l’attività del complesso SDH portando a mitocondri iperattivi e a una maggiore vitalità metabolica nelle cellule esposte alle radiazioni.

L’accumulo di calcio nei mitocondri porta a uno stato metabolico cellulare iperattivo

Inoltre, per comprovare il ruolo del Ca2+ nell’aumento della formazione di formazan, abbiamo provato se il disturbo del Ca2+ nelle cellule da solo può aumentare la vitalità metabolica. Per testare questa proposta, le cellule sono state trattate con lo ionoforo Ca2+ A23187 (2 µM, che aumenta il Ca2+ citoplasmatico, come le radiazioni ionizzanti) per 1 ora e abbiamo analizzato la vitalità metabolica a 4, 8 e 24 ore dopo il trattamento. È interessante notare che le cellule trattate con A23187 hanno mostrato un aumento significativo (1,6 volte) della vitalità metabolica per cella a 8 & 24 ore in HeLa e 4 & 8 ore in MDA-MB-231 (Fig. 6A), dopo il trattamento. Questi risultati suggeriscono che il Ca2+ citoplasmatico aumentato aumenta la vitalità metabolica, aumentando l’accumulo di Ca2+ nei mitocondri (Fig. 5C). Abbiamo anche controllato se l’inibizione dell’accumulo di Ca2+ nei mitocondri può ostacolare l’aumento della massa mitocondriale indotto dalle radiazioni. È interessante notare che le cellule trattate con l’inibitore dell’uniportatore mitocondriale di Ca2+, Ruthenium Red (RuR, che inibisce l’accumulo di Ca2+ nei mitocondri) hanno mostrato un aumento significativamente basso del contenuto mitocondriale (indotto dalla radiazione) rispetto alla sola radiazione (Fig. 6B). È noto che l’aumento di Ca2+ induce la biogenesi mitocondriale attraverso CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, che è anche una proteina residente mitocondriale nota per regolare l’espressione di PGC-1α37,41,42. Quindi concludiamo che l’inibizione dell’accumulo di Ca2+ nei mitocondri usando il rosso rutenio ha ridotto la massa mitocondriale, probabilmente inibendo la biogenesi mitocondriale. Inoltre, per convalidare se l’aumento di Ca2+ citoplasmatico indotto dalle radiazioni e il suo accumulo nei mitocondri portano a una maggiore vitalità metabolica nelle cellule irradiate, abbiamo trattato le cellule con BAPTA-AM (un chelante di calcio intracellulare) e RuR, 30 minuti prima dell’irradiazione. La chelazione del Ca2+ citoplasmatico aumentato usando BAPTA-AM (Fig. 6C) e inibendo l’accumulo di Ca2+ nei mitocondri usando RuR (Fig. 6D), entrambi hanno abrogato l’aumento della vitalità metabolica indotta dalle radiazioni dopo 24 e 48 ore di irradiazione nelle cellule HeLa e MDA-MB-231 (Fig. 6C e D). Questi risultati suggeriscono che il disturbo indotto dalle radiazioni nell’omeostasi del Ca2+ gioca anche un ruolo importante nell’iperattivazione dei mitocondri e nell’aumento della vitalità metabolica, probabilmente a monte della biogenesi mitocondriale.