Testul în plăci

Testul în plăci poate fi utilizat pentru a purifica o populație clonală de virus sau pentru a determina titrul viral ca unități formatoare de plăci pe ml (pfu/ml), astfel încât să poată fi utilizate cantități cunoscute de virus pentru a infecta celulele în timpul lucrărilor ulterioare. În acest test, monostraturile de celule sunt infectate cu un raport scăzut de virus, astfel încât celulele sporadice să fie infectate. O suprapunere de agaroză menține celulele stabile și limitează răspândirea virusului. Atunci când fiecare celulă infectată produce virus și, în cele din urmă, se lizează, doar celulele imediat adiacente sunt infectate. Fiecare grup de celule infectate se numește placă. Celulele neinfectate înconjoară plăcile. După mai multe cicluri de infectare, celulele infectate din centrul plăcilor încep să se lizeze, iar celulele infectate periferice rămân înconjurate de celule neinfectate. Acest fenomen face ca lumina care trece prin celulele infectate să se refracteze diferit față de celulele neinfectate din jur, iar placa poate fi vizualizată fie cu ochiul liber, fie prin microscopie luminoasă. Fiecare placă reprezintă un singur virus. Prin urmare, populațiile virale clonale pot fi purificate prin izolarea plăcilor individuale. Plăcile individuale obținute din diferite diluții ale unui stoc viral pot fi numărate pentru a determina titlul viral (pfu/ml) al unei anumite transfecții sau al unui anumit stoc de virus. Starea celulelor și distribuția uniformă a acestora pe suprafața plăcii de cultură tisulară sunt importante pentru succesul testului cu plăci. Celulele trebuie să fie sănătoase, viabile în proporție de > 95 % ș i în faza logaritmică de creș tere în momentul testării. Celulele aglomerate, celulele care nu sunt distribuite uniform la densitatea corectă (>70%) pe placă și celulele care nu aderă la vasele de cultură tisulară în decurs de 30 de minute după implantare sunt în detrimentul testului.

Materiale suplimentare necesare:

Plaque Assay Agarose, Cat. Nr. 554766
Mediu celular de insecte nesuplimentat Grace’s
Ser fetal bovin
Placă de cultură de țesut, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. Nr. 353802
Baie de apă la 42°C

Protocol

Determinați numărul de plăci necesare

Pentru fiecare stoc de co-transfecție sau de virus (și control pozitiv) faceți dubluri de diluții în serie (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Etichetați fiecare placă de 60 mm cu descrierea probei și a diluției.

Însămânțați placa de cultură cu celule de insecte

1. Însămânțați 2,3 x 10 6 celule Sf9 pe fiecare placă de 60 mm. Se balansează ușor plăcile înainte și înapoi, apoi dintr-o parte în alta pentru a distribui uniform celulele pe suprafața plăcii. Nu învârtiți niciodată placa; acest lucru determină o distribuție neuniformă a celulelor. După ce plăcile au fost însămânțate, lăsați celulele să adere timp de 30 de minute până la o oră. În acest timp, pregătiți soluția de agar și diluțiile virale. Vizualizați, prin microscopie optică, pentru a confirma >confluența de 70% și distribuția uniformă a celulelor.

Pregătiți soluția de agaroză

Celele placate se suprapun cu o soluție de agaroză de 1% în mediu de celule de insecte Grace’s Insect Cell Medium suplimentat cu 10% FBS.

1. În primul rând, echilibrați baia de apă la 42°C. Determinați volumul total de soluție de agar necesar: înmulțiți 4 ml/placă cu numărul de teste de placă. Din acest volum total, o jumătate va fi dH 2 O + agaroză autoclavată pentru a obține o soluție de 2%, iar cealaltă jumătate va fi Grace’s Insect Media suplimentată cu 10% FBS. Pentru a determina cantitatea, în grame, de agaroză pentru teste de placă necesară pentru a obține o soluție finală de agaroză de 1%, înmulțiți volumul total cu 0,01. (De exemplu, 10 plăci x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Adaugați cantitatea corespunzătoare de dH 2 O autoclavizat într-o sticlă de sticlă sterilă de dimensiuni corespunzătoare. Apoi, adăugați LENT cantitatea calculată de agaroză, în timp ce agitați ușor pentru a amesteca dH 2 O și agaroza. Se pune amestecul la cuptorul cu microunde până la punctul de fierbere. Scoateți sticla și verificați amestecul pentru a vedea dacă există agaroză nedizolvată. Dacă este prezentă, se continuă încălzirea. Repetați până când agaroza s-a dizolvat complet (ATENȚIE: amestecul și aburul care îl însoțește sunt foarte fierbinți și se pot arde. Folosiți echipament de siguranță/precauții adecvate). Odată ce agaroza s-a dizolvat complet, închideți flaconul și transferați-l în baia de apă la 42°C. Lăsați amestecul să se răcească până la 42°C.
3. Obțineți mediul pentru insecte Grace’s Insect Media și adăugați ser fetal bovin la 10%. Exemplu: pentru 100 ml de Grace’s Insect Media, adăugați 10 ml de FBS. Așezați amestecul Grace’s media + 10% FBS în baia de apă la 42°C.

Pregătiți diluțiile virale în serie

1. Pentru fiecare co-transfecție, etichetați șase tuburi sterile de 15 ml de la 10 -1 la 10 -6 cu descrierea corespunzătoare a probei. Adăugați 2,7 ml de mediu TNM-FH în fiecare tub. Adăugați 0,3 ml din supranaturalul de co-transfecție în primul tub, se vortexează tubul. Efectuați diluții în serie transferând 0,3 ml la diluția următoare, folosind de fiecare dată o pipetă nouă.

Infectați celulele monostrat

1. În acest moment, celulele au avut suficient timp pentru a adera la suprafața plăcii. Verificați mai multe plăci la un microscop optic pentru a confirma o confluență de 70% și o distribuție uniformă a celulelor.
2. Lucrând cu plăcile duplicate ale fiecărei diluții, aspirați cu atenție mediul din celule folosind un vârf de pipetă steril de 200 µl și vacuum. Nu întrerupeți foaia celulară. Adăugați 1 ml din diluția virală corespunzătoare în fiecare dintre plăcile duplicate și agitați ușor placa înainte și înapoi, apoi dintr-o parte în alta pentru a distribui uniform virusul. Se repetă cu toate plăcile și diluțiile corespunzătoare.
3. Buclați ușor plăcile la temperatura camerei, în hota sterilă, la fiecare 15 minute, timp de 1 oră.

Suprapuneți celulele infectate cu agaroză

1. După 1 oră, confirmați că soluția de agaroză este la 42°C. Soluția trebuie să fie suficient de caldă, astfel încât să fie încă în stare lichidă, dar trebuie să fie suficient de rece pentru a fi ținută în mână. Dacă nu puteți ține confortabil sticla, soluția este prea fierbinte și va ucide celulele Sf9. Confirmați că mediul Grace’s Insect Media w/ 10% FBS este la 42°C. Dacă da, adăugați un volum egal la soluția de agaroză pentru a completa soluția finală de agar. Amestecați bine soluția finală de agarosă.
2. După ce soluția este gata, puneți-o într-un pahar de sticlă umplut cu apă din baia de apă. Acest lucru ar trebui să împiedice soluția să se solidifice în timp ce o folosiți sub hotă. În timpul procedurii, verificați periodic temperatura apei din paharul de laborator. Dacă aceasta începe să se răcească, înlocuiți-o cu apă caldă din baia de apă.
3. Lucrând cu câte o pereche de duplicate, aspirați cu grijă mediul din celule folosind un vârf de pipetă steril de 200 µl și vacuum. Nu întrerupeți foaia celulară. În timp ce aspirați, înclinați ușor placa și aspirați supernatantul de pe marginea plăcii. Acest lucru va permite o aspirare optimă fără a perturba folia celulară. După aceea, adăugați încet 4 ml de soluție de agar pe fiecare placă și lăsați agarul să se solidifice.
4. După ce agarul de pe toate plăcile s-a solidificat, așezați cu grijă plăcile într-o cameră de incubare curată și ermetică. Umidificați camera prin plasarea unui tifon steril și a 10 ml de apă sterilă într-un vas de cultură de 10 mm pe suportul inferior al camerei de incubare. Se închide ermetic camera și se introduce într-un incubator la 27°C. Lăsați plăcile să se incubeze timp de 6 – 10 zile.
5. Placilele pot fi vizualizate prin răsturnarea plăcilor pe un fond întunecat și iluminarea lor cu o sursă de lumină puternică din partea laterală a plăcii sau prin ținerea lor la un unghi de 45° într-o sursă de lumină. Atunci când învățați cum să identificați o placă, încercuiți plăcile posibile cu un marker. Folosind microscopul de lumină, vizualizați la putere mică pentru a confirma că există o zonă de curățare în peluza de celule. Vizualizați la putere mare pentru a căuta celule infectate la periferia zonei de curățare, apoi mai puține celule infectate pe măsură ce vă îndepărtați de zona de curățare.
6. Pentru a facilita vizualizarea plăcilor, suprapuneți 3 ml de agaroză 0,5% (preparată conform descrierii anterioare) care conține 50 µg/ml de roșu neutru. (Se prepară o soluție stoc de roșu neutru (Sigma N7005) la 1 mg/ml în apă sau PBS. Se sterilizează prin filtrare și se păstrează la 4°C la întuneric). Se lasă să se întărească și se incubează placa peste noapte la 27°C. Roșul neutru va colora celulele sănătoase, iar plăcile vor apărea ca zone clare, cu un diametru de aproximativ 0,5 – 3 mm pe un fond alb. Deoarece roșul neutru este un colorant vital, este important să se coloreze în timp ce monostraturile celulare sunt sănătoase, adică între 4 și 7 zile după infecție.

Purificarea plăcilor din stocul viral

Pentru a asigura o izolare adecvată, este mai bine ca plăcile să fie prelevate din plăci care conțin mai puțin de 50 de plăci. Se aplică mai multe diluții de virus pentru a se asigura că se obține un număr suficient de mic de plăci. Plăcile pot fi prelevate folosind vârfuri de micropipetă sterile (1 000 µl) sau tuburi microcapilare.

Amplificarea virusului din prelevarea plăcilor

1. Marcați placa de sub placă cu un marker. Cu ajutorul unui vârf de pipetă steril, îndepărtați un dop de agaroză direct deasupra plăcii. Prelevați între 10 și 100 de plăci în acest mod.
2. Puneți fiecare dop de agaroză într-un tub de microcentrifugare separat care conține 1 ml de mediu de cultură tisulară. Eliberați particulele de virus din agaroză prin rotirea tubului peste noapte la 4°C.
3. Adaugați 200 µl din fiecare placă prelevată în godeuri separate ale unei plăci de cultură tisulară cu 12 puțuri însămânțate cu 2 x 10 5 celule pe puț în 1 ml de mediu TNM-FH proaspăt. Incubați plăcile timp de 3 zile la 27°C.
4. Supernatantul virusului din acest stoc de primă trecere poate fi colectat și centrifugat timp de 5 minute la 1.000 x g la 4°C pentru a elimina resturile. Se păstrează la 4°C.
5. Se însămânțează o placă de cultură tisulară de 100 mm cu 5 x 10 6 celule pentru fiecare izolat de placă. Lăsați celulele să se atașeze și înlocuiți mediul cu 10 ml de mediu TNM-FH proaspăt.
6. Adaugați 200 µl din stocul de trecere unu la placa de 100 mm și incubați la 27°C timp de 4 zile. Păstrați restul de 800 µl din stocul de trecere-unu la 4°C ca rezervă.
7. Recoltați supernatantul viral și centrifugați pentru a elimina resturile. Determinați titrul acestui stoc de trecere-două. Dacă titrul rămâne sub 2 x 10 8 pfu/ml, treceți la Amplificarea Baculovirusului.

.