După ce a absolvit Southwest Texas State University din San Marcos, Texas, Boothe s-a alăturat companiei de repertoriu a Festivalului Shakespeare din Oregon, cu roluri în Henry IV, partea a doua (interpretându-l pe Henry al IV-lea al Angliei), Troilus și Cressida, și altele. Debutul său pe scena newyorkeză a fost în producția din 1974 a Lincoln Center, Richard al III-lea. Cinci ani mai târziu, debutul său în teatrul de pe Broadway a venit cu un rol principal în piesa într-un act Lone Star, scrisă de James McLure.
Boothe a intrat pentru prima dată în atenția națională în 1980, interpretându-l pe Jim Jones în filmul CBS-TV Guyana Tragedy: The Story of Jim Jones. Portretul lui Boothe al liderului nebun al cultului a fost aclamat de critici. În articolul publicat de Time despre această producție, Boothe a fost lăudat: „Există o interpretare extraordinară. Un tânăr actor pe nume Powers Boothe captează toată carisma și răutatea lui „tata”, Jim Jones.” Boothe a câștigat premiul Emmy pentru rolul său, învingându-i pe veteranii Henry Fonda și Jason Robards. Cum Screen Actors Guild era în grevă în toamna anului 1980, el a fost singurul actor care a traversat liniile de pichetare pentru a participa la ceremonii, spunând la momentul respectiv: „Acesta poate fi fie cel mai curajos moment al carierei mele, fie cel mai prostesc.”
Boothe l-a interpretat pe Philip Marlowe într-un serial TV bazat pe povestirile lui Raymond Chandler pentru HBO în anii 1980. A apărut în filme precum Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire și Extreme Prejudice, precum și în filmele HBO Into the Homeland și By Dawn’s Early Light. În plus, a apărut în 1990 în filmul CBS-TV Family of Spies (Familia de spioni), în care l-a interpretat pe ofițerul de marină trădător John Walker. Boothe l-a întruchipat pe Curly Bill Brocius în westernul de succes din 1993 Tombstone, pe ofițerul superior neloial al armatei în Blue Sky (alături de interpretarea premiată cu Oscar a Jessicăi Lange) și pe sinistrul terorist principal în Sudden Death. De asemenea, a făcut parte din distribuția marelui ansamblu din Nixon (în rolul șefului de stat major Alexander Haig) și U Turn (în rolul șerifului orașului), de Oliver Stone.
În 2001, a jucat rolul lui Flavius Aëtius, generalul roman însărcinat cu oprirea invaziei hunilor în miniseria realizată pentru televiziune Attila. Boothe a jucat un rol principal în rolul proprietarului de bordel Cy Tolliver în serialul HBO Deadwood, precum și în rolul senatorului de mahala Roark în filmul Sin City (2005), precum și în continuarea acestuia, Sin City: A Dame to Kill For (2014). Este vocea unuia dintre personajele din jocul video Area 51 din 2005 și a lui Gorilla Grodd, super-răufăcătorul telepatic hiperinteligent din Justice League și Justice League Unlimited. A dat voce răufăcătorului, Kane, în jocul video Turok din 2008.
A fost invitat special în serialul 24, unde a jucat rolul vicepreședintelui Noah Daniels. A revenit în prequel-ul celui de-al șaptelea sezon, 24: Redemption. Imediat după ce a preluat rolul de președinte interimar, Boothe este văzut ieșind din Air Force Two cu F-15 în fundal. Boothe a jucat rolul unui pilot de F-15 doborât în Red Dawn. În martie 2008, el a narat o reclamă de campanie televizată pentru campania prezidențială a senatorului John McCain.
În 2012, Boothe a apărut în filmul lui Joss Whedon, The Avengers, într-un rol secret, ca un superior guvernamental din umbră al lui S.H.I.I.E.L.D. În 2015-16, a reluat rolul, numit acum Gideon Malick, în serialul ABC Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe a apărut în miniseria Hatfields & McCoys din 2012 în rolul judecătorului Valentine „Wall” Hatfield. Boothe a fost, de asemenea, distribuit ca Lamar Wyatt în serialul dramatic muzical ABC Nashville. Boothe și-a împrumutat, de asemenea, vocea în Hitman: Absolution, un joc video din 2012 dezvoltat de IO Interactive, dându-i voce personajului Benjamin Travis.
.