PMC

TEXT

Streptococii sunt cei mai abundenți locuitori ai gurii umane (6, 24) și au acces frecvent în fluxul sanguin prin leziuni parodontale sau abraziuni orale create de activitățile de rutină (32). Acest lucru poate duce la boli grave, inclusiv endocardită infecțioasă (EI) (28) și bacteriemie neutropenică (29). Taxonomia streptococilor orali a fost mult timp o sursă de confuzie (4, 9, 20, 22, 31). Secvențierea genei ARNr 16S a clarificat foarte mult situația (13); cu toate acestea, această abordare nu are sensibilitatea necesară pentru a distinge anumite specii strâns înrudite, inclusiv Streptococcus mitis și Streptococcus oralis (12), sau pentru a permite tipizarea tulpinilor sau analiza filogenetică în cadrul speciilor. Prin urmare, au fost examinate genele care posedă o variabilitate mai mare, inclusiv spacerul transcris intergenic (ITS) al ARNr 16S-23S (2), genele de menținere a menținerii proteinei (1, 5, 7, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23) sau ambele (17, 18). Nu s-a ajuns încă la un consens în ceea ce privește gena (genele) cea mai potrivită pentru aceste scopuri. Mai mult, deși studiile anterioare au identificat streptococi orali din hemoculturi clinice folosind metode de secvențiere definitive (12, 23, 30), niciunul nu a raportat informații clinice detaliate despre boala de bază. Ne-am propus să le facem pe amândouă.

Culturile de sânge efectuate la Virginia Commonwealth University Medical Center Hospital din mai 2003 până în mai 2008 au fost identificate prezumtiv ca conținând streptococi de către laboratorul de microbiologie clinică. Un script computerizat a fost utilizat pentru a exclude speciile non-orale. Pentru a evita analiza contaminanților, au fost solicitate plăci de izolare numai atunci când două sau mai multe rapoarte proveneau din culturi separate ale aceluiași pacient. O colonie din fiecare placă de izolare disponibilă a fost crescută în cultură de bulion și examinată macroscopic și microscopic. În cazul în care au fost observate diferențe în culturile separate provenite de la același pacient, ambele culturi au fost reținute. În caz contrar, o singură cultură de la fiecare pacient a fost crioconservată, iar alicoturile au fost prelevate pentru amplificarea PCR.

Pentru a determina identitatea speciei și înrudirea filogenetică a fiecărui izolat, ITS 16S-23S a fost amplificat cu ajutorul primerilor 6R și 13BF descriși anterior (2). În cazul în care nu s-au obținut produse de la unele izolate, am observat că ultimele trei nucleotide ale primerului 6R nu s-au aliniat cu secvențele ARNr 23S din GenBank de la mai multe specii de interes. Prin urmare, am scurtat și am simplificat amorsa 6R, creând 6R-S, și am scurtat amorsa 13BF pentru a se potrivi cu temperatura de aneantizare a acesteia (a se vedea tabelul S1 din materialul suplimentar). O modificare similară a primerului 6R a fost raportată recent (18). Utilizând acești amorse, ampliconii PCR au fost obținuți de la toate izolatele și au fost supuși analizei capilare a secvențelor de ADN.

Majoritatea secvențelor de ADN conțineau ITS complet și porțiuni din genele ARNr 16S și 23S, care au fost aliniate cu secvențele ITS din tulpinile tip disponibile în GenBank sau determinate de noi din tulpini obținute de la American Type Culture Collection (ATCC). Am constatat că secvențele flancate 16S și 23S, deși nu se păstrează în majoritatea secvențelor publicate, au facilitat alinierea ITS. Într-adevăr, au fost publicate cel puțin patru secvențe de tulpini tip (18) în care un CTAAGG situat cu 78 pb înainte de capătul 3′ al genei ARNr 16S pare să fi fost confundat cu o secvență hexanucleotidă identică definită anterior (2) ca fiind începutul ITS. Secvențele ITS tăiate (2) au fost apoi comparate și aliniate cu ajutorul software-ului MEGA 4 (25) pentru a construi un arbore filogenetic de tip neighbor-joining (Fig. 1).

S-a sugerat anterior că analiza ITS singură este suficientă pentru identificarea speciilor de streptococi orali, inclusiv cea a speciilor strâns înrudite S. mitis și S. oralis. S-a sugerat că delețiile conservate de o singură bază în două locuri și o lungime totală a ITS de 246 pb sunt caracteristice pentru S. oralis, în timp ce pentru S. mitis s-a propus să nu aibă deleții și să posede un ITS de 248 până la 249 pb (2, 3). În studiul nostru, am găsit izolate ale ambelor specii care posedau ambele deleții sau niciuna dintre ele, împreună cu lungimi ITS care se suprapun. Astfel, izolatele de S. oralis și S. mitis nu au putut fi distinse în mod fiabil după aceste criterii. Un alt studiu a sugerat că analiza secvenței ITS, deși nu este suficientă pentru a distinge S. oralis și S. mitis, este suficientă pentru identificarea multor alte specii streptococice orale, inclusiv a celor care aparțin grupului anginosus (18). Cu toate acestea, am găsit un izolat al speciei S. intermedius din grupul anginosus (VMC38) care nu a putut fi clasificat prin ITS (a se vedea tabelul S1 în materialul suplimentar).

Un număr mare de izolate, în special pentru S. mitis și Streptococcus constellatus, au posedat, de asemenea, secvențe identice, ceea ce a împiedicat analiza filogenetică. Secvențe identice au fost obținute, de asemenea, de la cinci perechi de izolate provenite de la aceiași pacienți (date neevidențiate).

Pentru că analiza ITS nu a fost suficientă pentru scopurile noastre, am secvențiat o a doua țintă comună – gena sodA, care codifică superoxid dismutaza dependentă de mangan (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Acest lucru a permis excluderea mai multor izolate. Perechile de tulpini menționate mai sus ca provenind de la aceiași subiecți și având secvențe ITS identice posedau, de asemenea, secvențe sodA identice, ceea ce a confirmat că izolatele erau identice, iar un izolat din fiecare pereche a fost eliminat. Două izolate au fost eliminate din cauza unei greșeli aparente de manipulare a tulpinii, iar o alta nu a fost reținută deoarece secvențele ITS și sodA indicau că era o tulpină de Enterococcus faecalis. Un arbore filogenetic derivat din izolatele rămase este prezentat în Fig. 1.

Aliniamentul sodA a fost superior celui al ITS pentru analiza filogenetică. Singurele izolate cu secvențe sodA identice au fost două tulpini de S. mitis și două tulpini de Streptococcus vestibularis. Alinierea sodA a fost, de asemenea, mai utilă pentru determinarea speciilor. Toate tulpinile de referință au fost bine separate unele de altele în arborele filogenetic. Rezultatul a fost doar patru atribuiri de specii ambigue pentru sodA, în comparație cu 15 pentru ITS (a se vedea tabelul S1 în materialul suplimentar). În acele cazuri în care o singură denumire de specie a fost compatibilă atât cu secvențele ITS, cât și cu sodA, a fost utilizată această denumire. Doar 3 din cele 58 de izolate clinice finale nu au putut fi identificate cu încredere prin această metodă. Izolatele VMC1 și VMC43 au produs secvențe ITS care au fost prea scurte pentru a fi informative, în ciuda încercărilor repetate de secvențiere, iar VMC58 a fost identificat în mod inconsecvent prin secvențele ITS și sodA (Fig. 1; tabelul S1). Am confirmat identitatea de specie a acestor izolate utilizând o bază de date publicată recent, care conține secvențele a șapte gene de menținere a identității de la 420 de tulpini streptococice bine caracterizate, inclusiv sodA, pfl și pyk (1). Secvențele genelor pfl și/sau pyk din toate tulpinile discutabile au fost determinate și aliniate cu secvențele din baza de date eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), la fel ca și secvențele sodA existente. În toate cazurile, atribuirea speciilor pfl și pyk a fost în concordanță cu cele din sodA. În plus, alinierea sodA a indicat faptul că secvența VMC58, deși divergentă față de tulpina tip, s-a încadrat într-un grup de 13 izolate de Streptococcus infantis din baza de date (datele nu sunt prezentate). Identificarea consensuală a speciilor pentru toate izolatele incluse în studiu este indicată în Fig. 1 și în tabelele S1 și S2 din materialul suplimentar.

În timp ce aceste rezultate sugerează că analiza sodA singură este suficientă pentru identificarea majorității tulpinilor, recomandăm includerea a cel puțin o genă de menținere suplimentară codificatoare de proteine pentru toate tulpinile. Mulți streptococi orali sunt competenți în mod natural și au fost raportate cazuri de achiziție de gene de menținere străine, inclusiv sodA, (1, 12). Acest lucru nu a fost evident în studiul nostru, dar au existat cazuri de secvențe ITS (VMC38 și VMC50) și sodA (VMC33) chimerice. Două publicații recente au mers mai departe, fiecare dintre ele sugerând secvențierea unui set diferit de șapte gene de menținere a proprietății pentru tipărirea secvențelor multilocus (7) sau pentru analiza secvențelor multilocus (1). Aceste abordări se bazează pe analiza unui număr mai mare de gene pentru a oferi o rezoluție mai mare și pentru a minimiza efectele genelor chimerice sau străine ocazionale (1, 7). Aceste scheme permit, de asemenea, efectuarea unor analize filogenetice mai sofisticate decât sunt posibile cu doar două sau trei gene. Cu toate acestea, am întâmpinat ocazional dificultăți în ceea ce privește amplificarea și secvențierea genelor pfl și pyk și am avut puțin succes cu două dintre celelalte gene recomandate, map și ppaC (1). Un alt studiu recent a raportat dificultăți similare (27). Astfel, alegerea unor gene suplimentare poate necesita teste empirice, dar cele utilizate în analizele celor șapte gene ar trebui explorate mai întâi, deoarece sunt disponibile colecții mari de secvențe de la tulpini bine caracterizate pentru comparație (1, 7).

Din câte știm, acesta este doar al doilea raport al unui izolat de hemocultură Streptococcus australis (12) sau S. infantis (30). Singura altă asociere a acestei din urmă specii cu vreo boală provine din două rapoarte de izolare a acesteia din sputa adulților cu fibroză chistică (17, 26). Prin urmare, este interesant faptul că un adult cu fibroză chistică a fost sursa izolatului nostru de S. infantis, VMC58 (a se vedea tabelul S2 în materialul suplimentar).

Datele de sensibilitate la antibiotice sunt incluse în tabelul S2 și sunt în mare parte în concordanță cu studiile anterioare (8). Tabelul S2 oferă, de asemenea, date clinice și demografice pentru pacienții sursă, clasificându-i pe baza bolii principale de bază: boală medicală, malignitate, IE sau intervenție chirurgicală/traumatism. Toți subiecții cu EI au fost diagnosticați clinic și toți, cu excepția cazului VMC56 (tabelul S2), au fost clasificați ca „EI definită” prin criteriile Duke modificate (16). Singura excepție a avut un istoric de IE anterioară și de utilizare de droguri intravenoase (IVDU), care, împreună cu hemoculturile pozitive, ar duce la clasificarea ca „posibilă IE”. Au fost examinate, de asemenea, datele privind posibilele surse de infecție, inclusiv liniile centrale, endoscopia gastrointestinală, mucozita orală, afecțiunile dentare și IVDU. IVDU a fost găsită pentru 9 dintre cei 13 pacienți cu EI și pentru doar un alt pacient din studiu (tabelul S2). Această diferență a fost semnificativă din punct de vedere statistic (P < 0,0001; testul exact al lui Fisher). Astfel, deși acest studiu s-a axat pe speciile orale, IVDU a fost un factor de risc copleșitor.

Analiza noastră filogenetică nu a scos la iveală nicio asociere semnificativă din punct de vedere statistic între o anumită specie sau tip clonal și boala de bază sau alți parametri clinici, inclusiv numărul de celule albe din sânge, temperatura cea mai ridicată, dimensiunea vegetației, valva afectată sau decesul pacientului. Un studiu anterior conținea suficiente informații pentru a identifica speciile izolate de la pacienții neutropenici (12). Rezultatele noastre au fost similare, în sensul că 11 din 12 izolate în acel studiu și 9 din 10 în studiul nostru (tabelul S2) au fost fie S. mitis, fie S. oralis, strâns înrudit. În studiul nostru, aceste două specii, luate împreună, au avut o probabilitate semnificativ mai mare decât cele 12 specii rămase combinate de a fi izolate de la pacienții neutropenici (P = 0,004; testul exact al lui Fisher). Acest lucru poate reflecta prevalența acestor specii în cavitatea bucală. Este interesant, totuși, că această tendință nu s-a transferat la IE. Combinând datele noastre cu cele din același studiu (12) pentru neutropenie și IE, S. oralis și S. mitis au fost izolate din 20 din 22 de cazuri de neutropenie și doar 15 din 27 de cazuri de IE, o diferență care a fost semnificativă din punct de vedere statistic (P = 0,01; testul exact Fisher). Ca și în studiile anterioare (11, 12, 30), numărul de eșantioane a limitat capacitatea noastră de a evalua cu încredere alte posibile asocieri între specii și anumite boli sau caracteristici clinice. Cu toate acestea, prin asocierea identificării definitive a speciilor cu caracteristicile clinice și demografice pentru fiecare pacient sursă (tabelul S2), am încercat să facem ca rezultatele noastre să fie adecvate pentru meta-analiză sau alte studii care utilizează date combinate.

.