Van ‘t Hoff și-a câștigat cea mai timpurie reputație în domeniul chimiei organice. În 1874, el a explicat fenomenul de activitate optică presupunând că legăturile chimice dintre atomii de carbon și vecinii lor sunt îndreptate spre colțurile unui tetraedru regulat. Această structură tridimensională a explicat izomerii întâlniți în natură. El împarte meritul pentru acest lucru cu chimistul francez Joseph Le Bel, care a venit independent cu aceeași idee.
Cu trei luni înainte de a i se acorda diploma de doctorat, Van ‘t Hoff a publicat această teorie, care astăzi este considerată fundamentul stereochimiei, mai întâi într-o broșură olandeză, în toamna anului 1874, și apoi în luna mai a anului următor, într-o mică carte franceză intitulată La chimie dans l’espace. O traducere în germană a apărut în 1877, într-o perioadă în care singurul loc de muncă pe care Van ‘t Hoff îl putea găsi era la Școala veterinară din Utrecht. În acești primii ani, teoria sa a fost în mare parte ignorată de comunitatea științifică și a fost aspru criticată de un chimist proeminent, Hermann Kolbe. Kolbe a scris:
„Un anume Dr. J. H. van ‘t Hoff de la Școala de Medicină Veterinară din Utrecht nu are nici o simpatie, aparent, pentru investigațiile chimice exacte. El a considerat mai convenabil să se urce pe Pegasus (aparent împrumutat de la Școala de Medicină Veterinară) și să proclame în lucrarea sa „La chimie dans l’espace” cum, în zborul său îndrăzneț până în vârful Parnasului chimic, atomii i s-au părut a fi aranjați în spațiul cosmic.”
Cu toate acestea, în jurul anului 1880, susținerea teoriei lui Van ‘t Hoff de către chimiști atât de importanți precum Johannes Wislicenus și Viktor Meyer a adus recunoaștere.
În 1884, Van ‘t Hoff a publicat cercetările sale privind cinetica chimică, intitulate Études de Dynamique chimique („Studii de dinamică chimică”), în care a descris o nouă metodă de determinare a ordinii unei reacții cu ajutorul graficii și a aplicat legile termodinamicii la echilibrele chimice. De asemenea, a introdus conceptul modern de afinitate chimică. În 1886, a demonstrat o asemănare între comportamentul soluțiilor diluate și cel al gazelor. În 1887, împreună cu chimistul german Wilhelm Ostwald, a fondat o influentă revistă științifică numită Zeitschrift für physikalische Chemie („Jurnalul de chimie fizică”). A lucrat la teoria lui Svante Arrhenius privind disocierea electroliților, iar în 1889 a oferit o justificare fizică pentru ecuația lui Arrhenius. În 1896, a devenit profesor la Academia Prusacă de Științe din Berlin. Studiile sale asupra zăcămintelor de sare de la Stassfurt au reprezentat o contribuție importantă la industria chimică a Prusiei.
Van ‘t Hoff a devenit profesor de chimie și fizică la Colegiul Veterinar din Utrecht. Apoi a lucrat ca profesor de chimie, mineralogie și geologie la Universitatea din Amsterdam timp de aproape 18 ani, înainte de a deveni, în cele din urmă, președinte al departamentului de chimie. În 1896, Van ‘t Hoff s-a mutat în Germania, unde și-a încheiat cariera la Universitatea din Berlin în 1911. În 1901, a primit primul Premiul Nobel pentru Chimie pentru activitatea sa cu soluții. Lucrările sale au arătat că soluțiile foarte diluate urmează legi matematice care se aseamănă foarte mult cu legile care descriu comportamentul gazelor.
.