00:00:07.25Bună ziua, numele meu este Jennifer Doudna de la UC Berkeley
00:00:09.26și mă aflu astăzi aici pentru a vă povesti despre cum am descoperit
00:00:12.26o nouă tehnologie de inginerie a genomului.
00:00:00:15.07Această poveste începe cu un sistem imunitar bacterian
00:00:20.12înseamnă înțelegerea modului în care bacteriile
00:00:22.14se luptă împotriva unei infecții virale.
00:00:24.26Se pare că o mulțime de bacterii
00:00:28.04au în cromozomul lor,
00:00:00:30.09care este ceea ce priviți aici
00:00:32.15o secvență de repetări arătate în aceste diamante negre
00:00:36.18care sunt intercalate cu secvențe
00:00:40.19lea care sunt derivate din virusuri
00:00:43.08și acestea au fost observate de microbiologi
00:00:46.20care secvențiau genomurile bacteriene, dar nimeni nu știa
00:00:50.10care ar putea fi funcția acestor secvențe
00:00:53.06până când s-a observat că ele tind să apară de asemenea
00:00:58.09cu o serie de gene care adesea codifică proteine
00:01:03.29care au homologie cu enzime care fac lucruri interesante
00:01:09.03cum ar fi repararea ADN-ului.
00:01:10.12Așa că a fost o ipoteză că acest sistem
00:01:14.04care a ajuns să fie numit CRISPR
00:01:16.08care este un acronim pentru acest tip de locus repetitiv
00:01:19.14că aceste sisteme CRISPR ar putea fi de fapt
00:01:22.29un sistem imunitar dobândit în bacterii
00:01:26.00care ar putea permite ca secvențele să fie integrate
00:01:29.06de la viruși și apoi folosite cumva mai târziu
00:01:32.07pentru a proteja celula de o infecție
00:01:35.26cu același virus.
00:01:37.05Așa că aceasta a fost o ipoteză interesantă
00:01:39.11și ne-am implicat în studiul acesteia
00:01:41.18la mijlocul anilor 2000, imediat după publicarea
00:01:44.15de trei lucrări care evidențiau
00:01:47.13încorporarea secvențelor virale
00:01:50.00în acești loci genomici.
00:01:52.07Și astfel ceea ce a apărut în următorii câțiva ani
00:01:55.17a fost că, de fapt, aceste sisteme CRISPR
00:01:58.08sunt de fapt sisteme imunitare dobândite în bacterii
00:02:01.18astfel încât până în acest moment nimeni nu știa că bacteriile
00:02:04.24pot avea de fapt o modalitate de a se adapta
00:02:08.08la virușii care intră în celulă
00:02:10.29dar acesta este un mod în care o fac
00:02:12.14și implică detectarea ADN-ului străin
00:02:15.17care este injectat, așa cum se arată în acest exemplu
00:02:18.04de la un virus care intră în celulă
00:02:20.07sistemul CRISPR permite integrarea
00:02:26.06de bucăți scurte din aceste molecule de ADN viral
00:02:29.15în locusul CRISPR
00:02:31.07și apoi, în a doua etapă
00:02:33.27care este prezentată aici ca biogeneză a ARN-ului CRISPR
00:02:38.20aceste secvențe CRISPR sunt de fapt transcrise
00:02:42.20în celulă în bucăți de ARN
00:02:45.15care sunt ulterior folosite împreună
00:02:48.23cu proteinele codificate de genele CAS
00:02:52.09aceste gene asociate cu CRISPR
00:02:54.01pentru a forma complexe de interferență sau de interferență
00:02:58.12care pot folosi informația sub forma
00:03:01.17aceste molecule de ARN pentru a face pereche de baze
00:03:04.08cu secvențe corespunzătoare din ADN-ul viral.
00:03:07.18 Deci, o modalitate foarte ingenioasă pe care bacteriile
00:03:10.12au găsit-o pentru a-și lua invadatorii
00:03:13.06și a întoarce informația secvenței împotriva lor.
00:03:17.00 Deci, în propriul meu laborator
00:03:20.21suntem foarte interesați de mult timp
00:03:23.09înțelegerea modului în care moleculele de ARN
00:03:26.03sunt folosite pentru a ajuta celulele să își dea seama
00:03:32.00cum să regleze expresia proteinelor
00:03:34.03din genom.
00:03:35.05Și astfel, acesta părea a fi un exemplu foarte interesant
00:03:37.27și
00:03:39.18am început să studiem mecanismele moleculare de bază
00:03:42.24prin care funcționează această cale.
00:03:45.01Și în 2011 am mers la o conferință științifică
00:03:49.23și am întâlnit o colegă de-a mea,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier care este prezentată în această imagine
00:03:56.10în extrema stângă și laboratorul lui Emmanuelle
00:03:58.14lucrează la probleme de microbiologie și sunt
00:04:02.11interesați în special de bacteriile
00:04:04.00care sunt agenți patogeni pentru om.
00:04:06.01Ea studia un organism numit
00:04:08.03Streptococcus pyogenes care este o bacterie
00:04:11.15care poate provoca infecții foarte grave la oameni
00:04:14.25și ceea ce era curios la acest microb era că
00:04:16.25are un sistem CRISPR și în acest organism
00:04:19.06exista o singură genă care codifica o proteină
00:04:21.27cunoscută sub numele de Cas9
00:04:23.12care s-a dovedit genetic a fi necesară
00:04:26.09pentru funcționarea sistemului CRISPR
00:04:28.16în Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23dar nimeni nu știa la acel moment care era funcția
00:04:33.05acelei proteine.
00:04:34.20Și astfel ne-am reunit și am recrutat
00:04:37.20oameni din laboratoarele noastre de cercetare respective
00:04:40.26pentru a începe să testăm funcția lui Cas9.
00:04:43.17Așa că oamenii cheie din proiect
00:04:45.20sunt arătați aici în fotografie
00:04:48.00în centru este Martin Jinek
00:04:50.03care este asociat postdoctoral în propriul meu laborator
00:04:52.17și alături de el, în cămașă albastră
00:04:54.22este Kryztof Chylinski care a fost student
00:04:57.20în laboratorul lui Emmanuelle
00:04:58.26și deci acești doi băieți împreună cu
00:05:00.21Ines Fonfara care este în extrema dreaptă,
00:05:02.10un postdoctorand cu Emmanuelle
00:05:04.01au început să facă experimente peste Atlantic
00:05:07.25și să-și împărtășească datele.
00:05:10.09Și ceea ce și-au dat seama a fost că
00:05:13.06Cas9 este de fapt o proteină fascinantă
00:05:16.04care are capacitatea de a interacționa cu ADN-ul
00:05:19.28și de a genera o ruptură dublu catenară
00:05:22.02în ADN la secvențe care se potrivesc
00:05:25.06cu secvența dintr-un ARN ghid
00:05:27.08și pe acest diapozitiv ceea ce vedeți
00:05:29.06este că ARN-ul ghid
00:05:30.10și secvența ghidului în portocaliu
00:05:32.11la perechile de baze cu o catenă
00:05:34.18din ADN-ul dublu elicoidal
00:05:37.11și, foarte important, acest ARN
00:05:39.28interacționează cu o a doua moleculă de ARN
00:05:42.09numită tracr care formează o structură
00:05:46.03care recrutează proteina Cas9
00:05:47.29astfel încât aceste două ARN-uri și o singură proteină
00:05:50.13în natură sunt cele necesare
00:05:52.23pentru ca această proteină să recunoască
00:05:56.05ceea ce ar fi în mod normal ADN-uri virale
00:05:58.11în celulă, iar proteina
00:06:01.13este capabilă să le taie,
00:06:02.14literalmente prin ruperea ADN-ului dublu elicoidal.
00:06:05.24Și atunci când ne-am dat seama de acest lucru
00:06:08.14ne-am gândit: nu ar fi uimitor
00:06:10.26dacă am putea genera de fapt un sistem mai simplu
00:06:13.29cum a făcut natura
00:06:15.02legând împreună aceste două molecule de ARN
00:06:18.04pentru a genera un sistem care ar fi o singură proteină
00:06:20.16și un singur ARN de ghidare.
00:06:22.28Așa că ideea a fost de a lua practic
00:06:25.17 aceste două ARN-uri pe care le vedeți pe partea îndepărtată
00:06:29.29din diapozitiv și apoi să le legăm practic împreună
00:06:33.19pentru a crea ceea ce numim
00:06:35.04un singur ARN ghid.
00:06:36.22Așa că Martin Jinek din laborator
00:06:38.25a făcut această construcție
00:06:40.21și am făcut un experiment foarte simplu
00:06:44.22pentru a testa dacă avem cu adevărat
00:06:46.18o enzimă programabilă de scindare a ADN-ului
00:06:49.29și ideea a fost să generăm ARN-uri ghid unice scurte
00:06:54.04care să recunoască diferite locuri într-o moleculă circulară de ADN
00:06:59.24pe care o vedeți aici
00:07:00.21și ARN-urile ghid au fost proiectate
00:07:03.10pentru a recunoaște secvențele arătate de barele roșii
00:07:06.17din diapozitiv și experimentul a fost apoi
00:07:10.16pentru a lua acea plasmidă, acea moleculă circulară de ADN
00:07:13.21și să o incubăm cu două enzime de restricție (sau de tăiere) diferite,
00:07:18.27una numită SalI care taie
00:07:21.23ADN-ul cam în amonte, la capătul cel mai îndepărtat
00:07:25.05din ADN-ul din această imagine
00:07:26.12în caseta gri,
00:07:27.19și al doilea situs fiind direcționat
00:07:31.00de către Cas9 ghidat de ARN
00:07:33.13la aceste situri diferite arătate în roșu.
00:07:35.16Și un experiment foarte simplu
00:07:37.19a făcut această reacție de incubare
00:07:39.26cu ADN plasmidic și acesta este rezultatul
00:07:43.24și deci la asta vă uitați
00:07:45.28este un gel de agaroză
00:07:47.29care ne permite să separăm
00:07:49.16moleculele scindate de ADN
00:07:51.20și ceea ce puteți vedea este că în fiecare dintre aceste benzi de reacție
00:07:54.22obținem o moleculă de ADN de dimensiuni diferite eliberată
00:07:58.12din acest plasmid dublu digerat
00:08:00.16în care dimensiunea ADN-ului
00:08:03.29correspunde scindării la diferite situsuri
00:08:06.11direcționate de aceste secvențe de ARN ghid
00:08:08.26indicate în roșu
00:08:10.24deci acesta a fost un moment cu adevărat interesant
00:08:12.29de fapt un experiment foarte simplu care a fost
00:08:15.15un fel de moment „Aha!”
00:08:17.03când am spus că avem într-adevăr o enzimă de tăiere a ADN-ului programabilă
00:08:22.02și că o putem programa cu o bucată scurtă de ARN
00:08:24.15pentru a tăia practic orice secvență de ADN dublu catenar
00:08:28.07de aceea motivul pentru care am fost atât de entuziasmați
00:08:30.23de o enzimă care poate fi programată
00:08:33.19pentru a genera rupturi de ADN dublu catenar
00:08:36.01în orice secvență este că
00:08:39.00a existat un set de experimente
00:08:42.16de lungă durată
00:08:42.16în comunitatea științifică care a arătat
00:08:45.13că celulele au modalități de reparare a rupturilor de ADN dublu catenar
00:08:49.26care duc la modificări
00:08:52.02în informația genomică din ADN
00:08:55.21astfel, acesta este un diapozitiv care arată că
00:08:58.20după ce o ruptură dublu catenară este generată
00:09:01.14de orice fel de enzimă care ar putea face acest lucru
00:09:04.13inclusiv sistemul Cas9
00:09:06.05aceste rupturi dublu catenare într-o celulă
00:09:09.07sunt detectate și reparate prin două tipuri de căi
00:09:13.15una din stânga care implică
00:09:17.26non-homologous end joining
00:09:20.07în care capetele ADN-ului sunt ligaturate chimic
00:09:24.07înapoi împreună, de obicei cu introducerea
00:09:26.18a unei mici inserții sau deleții
00:09:28.25în locul rupturii
00:09:29.27și în partea dreaptă
00:09:32.01este un alt mod în care are loc repararea
00:09:34.00prin repararea dirijată prin homologie
00:09:37.22în care o moleculă de ADN donator
00:09:39.14care are secvențe care se potrivesc cu cele
00:09:43.28care flanchează locul rupturii
00:09:45.12dublu-catenare poate fi integrat
00:09:48.05în genom la locul
00:09:50.10ruperii pentru a introduce o nouă informație genetică
00:09:54.06în genom
00:09:55.15astfel încât acest lucru a dat multor oameni de știință
00:09:59.04ideea că dacă ar exista un instrument
00:10:01.04sau o tehnologie care să permită
00:10:03.05cercetătorilor sau oamenilor de știință să introducă
00:10:06.12rupturi dublu-catenare în locurile vizate
00:10:09.00în ADN-ul unei celule, atunci, împreună
00:10:12.12cu toate datele de secvențiere a genomului
00:10:14.21care sunt acum disponibile, cunoaștem
00:10:16.10toată secvența genetică a unei celule
00:10:18.21și dacă ați ști unde a apărut o mutație
00:10:21.20care cauzează o boală, de exemplu
00:10:23.20puteți folosi o tehnologie ca aceasta
00:10:26.25pentru a introduce ADN care să repare o mutație
00:10:31.00sau să genereze o mutație
00:10:32.23pe care ați putea dori să o studiați într-un cadru de cercetare
00:10:35.04deci puterea acestei tehnologii este
00:10:38.28de fapt ideea că acum putem genera
00:10:41.20aceste tipuri de rupturi dublu catenare
00:10:43.17în locurile pe care noi le alegem ca oameni de știință
00:10:46.17prin programarea lui Cas9 și apoi să permitem
00:10:48.13celulei să facă reparații care introduc
00:10:51.04modificări genomice în locurile acestor rupturi
00:10:54.15dar provocarea a fost cum să generezi rupturile
00:10:58.11în primul rând și astfel au fost elaborate un număr
00:11:00.09de strategii diferite
00:11:03.24pentru a face acest lucru în diferite laboratoare
00:11:05.15cele mai multe dintre ele, și am de gând să arăt
00:11:08.21două exemple specifice aici
00:11:10.17unul numit nucleaze cu deget de zinc
00:11:12.25și celălalt domenii efectoare TAL
00:11:15.02aceștia sunt ambele moduri programabile
00:11:18.08pentru a genera rupturi bicatenare în ADN
00:11:20.21care se vor baza pe recunoașterea pe bază de proteine
00:11:23.29de secvențe de ADN, deci acestea sunt proteine
00:11:26.06care sunt modulare și pot fi generate
00:11:29.12în diferite combinații de module
00:11:31.22pentru a recunoaște diferite secvențe de ADN
00:11:34.03funcționează ca tehnologie
00:11:37.18dar necesită multă inginerie proteică
00:11:40.24pentru a face acest lucru, iar ceea ce este cu adevărat interesant
00:11:43.16despre această enzimă CRISPR/Cas9
00:11:46.11este faptul că este o proteină programată cu ARN
00:11:49.25astfel încât o singură proteină poate fi folosită pentru
00:11:52.09orice loc din ADN unde am
00:11:54.27ar dori să generăm o ruptură
00:11:56.13prin simpla modificare a secvenței
00:11:58.16a ARN-ului ghid asociat cu Cas9
00:12:00.24astfel încât, în loc să ne bazăm pe recunoașterea pe bază de proteine
00:12:03.06a ADN-ului, ne bazăm pe
00:12:06.04recunoașterea pe bază de ARN a ADN-ului
00:12:08.26așa cum se arată în partea de jos, deci ceea ce înseamnă
00:12:11.03este că este doar un sistem
00:12:12.18care este suficient de simplu de folosit
00:12:15.15pentru oricine cu pregătire de bază în biologie moleculară
00:12:19.05poate profita de acest sistem
00:12:20.29pentru a face ingineria genomului
00:12:22.20și, astfel, acesta este un instrument care într-adevăr
00:12:26.06Cred că completează o componentă esențială
00:12:29.03și care lipsea anterior
00:12:30.24din ceea ce am putea numi cutia de instrumente IT a biologiei
00:12:33.29care include nu numai capacitatea
00:12:36.00de a secvenția ADN-ul și de a se uita
00:12:38.06la structura sa, știm despre
00:12:39.24dubla helix încă din anii 1950
00:12:42.00și apoi, în ultimele decenii
00:12:44.18a fost posibil să folosim enzime
00:12:46.09cum ar fi enzimele de restricție
00:12:47.26și reacția în lanț a polimerazei
00:12:49.09pentru a izola și amplifica anumite segmente
00:12:52.19de ADN, iar acum cu Cas9
00:12:55.10avem o tehnologie care permite
00:12:57.15inginerie genomică facilă
00:12:59.13care este la dispoziția laboratoarelor din întreaga lume
00:13:03.07pentru experimentele pe care ar putea dori să le facă
00:13:05.08și așa că acesta este un rezumat al tehnologiei
00:13:10.11sistemului cu 2 componente
00:13:11.29se bazează pe perechile de baze ARN-ADN
00:13:14.16pentru recunoaștere
00:13:15.21și, foarte important, datorită modului în care
00:13:18.24a modul în care funcționează acest sistem este
00:13:19.28este de fapt destul de simplu
00:13:21.18pentru a face ceva numit multiplexare
00:13:24.20ceea ce înseamnă că putem programa Cas9
00:13:27.00cu mai multe ARN-uri ghid diferite
00:13:28.23în aceeași celulă pentru a genera
00:13:30.19multe rupturi și a face lucruri
00:13:32.06cum ar fi tăierea unor segmente mari de cromozomi
00:13:35.01și pur și simplu să le ștergem într-un singur experiment.
00:13:38.25Și astfel acest lucru a dus la o adevărată explozie
00:13:42.03în domeniul biologiei și geneticii
00:13:45.19cu multe laboratoare din întreaga lume
00:13:48.08adoptând această tehnologie
00:13:49.25pentru tot felul de aplicații foarte interesante
00:13:51.15și creative
00:13:53.13și acesta este un diapozitiv
00:13:54.24care este de fapt aproape depășit acum
00:13:56.11dar doar pentru a vă da o idee
00:13:57.14despre modul în care domeniul
00:14:00.07a luat cu adevărat avânt
00:14:01.08așa că am publicat lucrarea noastră originală despre Cas9
00:14:04.10în 2012 și până la acel moment
00:14:07.16existau foarte puține cercetări
00:14:08.18în curs de desfășurare pe biologia CRISPR oriunde
00:14:11.12era un domeniu foarte mic
00:14:12.19și apoi puteți vedea că
00:14:13.27începând din 2013 și extinzându-se
00:14:16.09până acum a avut loc această
00:14:17.21explozie incredibilă de publicații
00:14:20.16din partea laboratoarelor care folosesc
00:14:22.09aceasta ca o tehnologie de inginerie genomică
00:14:24.01astfel încât a fost foarte interesant pentru mine
00:14:26.25ca om de știință de bază să văd cum ceea ce a început
00:14:29.22ca un proiect de cercetare fundamentală
00:14:31.12se transformă într-o tehnologie care se dovedește a fi
00:14:34.08potrivită pentru tot felul
00:14:35.28de experimente interesante
00:14:37.07și am vrut doar să închei prin a vă împărtăși
00:14:40.07cu voi câteva lucruri
00:14:42.17care se întâmplă folosind această tehnologie
00:14:44.17și, desigur, în partea stângă
00:14:47.13o mulțime de biologie de bază care se poate face acum
00:14:50.02cu ajutorul ingineriei organismelor model
00:14:53.03și a diferitelor tipuri de linii celulare
00:14:55.02care sunt cultivate în laborator
00:14:56.21pentru a studia comportamentul celulelor
00:14:58.13dar, de asemenea, în biotehnologie, putând
00:15:01.23să facă modificări specifice în plante
00:15:05.15și în diferite tipuri de ciuperci care ar putea fi foarte
00:15:07.11utile pentru diferite tipuri de aplicații industriale
00:15:09.29și apoi, desigur, în biomedicină
00:15:12.14cu mult interes pentru potențialul
00:15:14.14de a folosi această tehnologie ca un instrument
00:15:17.03pentru a găsi noi terapii
00:15:21.06pentru bolile umane, cred că este ceva
00:15:23.09 care este foarte interesant și este ceva
00:15:26.05 care se află deja la orizont
00:15:27.09și apoi acest diapozitiv indică
00:15:30.20 unde cred că vom ajunge
00:15:33.15în viitor, cu o mulțime de direcții interesante
00:15:36.20și creative
00:15:39.03care apar în diferite laboratoare
00:15:41.02atât în laboratoarele de cercetare academică
00:15:43.19dar și din ce în ce mai mult în laboratoarele comerciale
00:15:45.29 care vor permite utilizarea acestei
00:15:49.24tehnologii pentru tot felul de aplicații
00:15:52.18multe dintre ele nici măcar nu le-am fi putut
00:15:54.10imagina acum doi ani.
00:15:56.05 Deci, foarte interesant și vreau doar să recunosc o echipă minunată
00:16:01.10de oameni care au fost implicați în lucrul
00:16:04.22la proiect cu mine și am
00:16:06.07a avut un sprijin financiar extraordinar din partea diferitelor grupuri
00:16:11.00de asemenea și a fost o plăcere
00:16:13.00să împărtășesc acest lucru cu voi, vă mulțumesc.
.