Imunohistochimia (IHC) este o tehnică puternică bazată pe microscopie pentru vizualizarea componentelor celulare, de exemplu a proteinelor sau a altor macromolecule în eșantioane de țesut. Punctul forte al IHC este rezultatul vizual intuitiv care dezvăluie existența și localizarea proteinei-țintă în contextul diferitelor tipuri de celule, stări biologice și/sau localizare subcelulară în cadrul țesuturilor complexe.
Tehnica IHC a fost inventată în anii 1940 (Coons, Creech, & Jones, 1941) și este utilizată în mod curent ca un instrument important în domeniul sănătății și al patologiei, de exemplu în scopuri de diagnosticare sau pentru a stratifica pacienții pentru regimuri de tratament optimizate. IHC este, de asemenea, utilizat pe scară largă în cercetare, unde moleculele de interes sunt analizate pentru a studia rolurile acestora atât în celulele și țesuturile sănătoase, cât și în cele bolnave, la nivel molecular, celular sau tisular. Există multe moduri diferite de a realiza vizualizarea țintelor în țesuturi folosind IHC sau metode bazate pe IHC și există numeroase protocoale pentru diferite aplicații și teste. Chiar dacă IHC este, în general, o metodă robustă și consacrată, noile teste necesită adesea o optimizare atentă în funcție de țesut sau de proprietățile proteinei-țintă, ale moleculei de legare și/sau ale sistemului reporter. Mulți ani de dezvoltare tehnică și disponibilitatea foarte mare a moleculelor de legare specifice au îmbunătățit considerabil utilitatea și domeniile de aplicare a IHC. Progresul în domeniul tehnicilor și reactivilor pe bază de IHC a permis oamenilor de știință și furnizorilor de servicii medicale să dispună de instrumente, teste și biomarkeri mai preciși. În plus, progresele tehnice au permis, de exemplu, detectarea simultană extrem de sensibilă a mai multor proteine în aceeași probă, precum și detectarea interacțiunilor proteină-proteină (a se vedea testul de legare de proximitate).
Testul IHC clasic este ilustrat în figura 1 și implică detectarea epitopilor exprimați de o singură proteină-țintă în cadrul unei probe de țesut, utilizând un „anticorp primar” capabil să se lege de acei epitopi cu o specificitate ridicată. După evenimentul de legare a epitopului de anticorp, se adaugă un „anticorp secundar” capabil să se lege de anticorpul primar cu o mare specificitate. Anticorpul secundar este cuplat la o moleculă reporter și, după evenimentul de legare anticorp-anticorp, se adaugă un substrat chimic care reacționează cu molecula reporter pentru a produce un precipitat colorat la locul unde se află întregul complex epitop-anticorp.
Figura 1. Principiul de bază al imunohistochimiei.
În ilustrația schematică (figura 1), o secțiune de țesut fixată în formol și încorporată în parafină este colorată cu ajutorul unui anticorp primar îndreptat spre o țintă proteică specifică. O soluție care conține anticorpul primar se adaugă la secțiunea de țesut, iar anticorpilor li se lasă un anumit timp pentru a găsi și a se lega de ținta lor. După această etapă, anticorpii nelegate și excedentare sunt spălate și se adaugă anticorpul secundar. Anticorpului secundar, care poartă o moleculă de legătură cu enzime de peroxidază de hrean (HRP), i se lasă, de asemenea, un timp pentru a se lega de anticorpul primar, urmat de o altă etapă de spălare. După aceasta, se adaugă 3,3′ diaminobenzidină (DAB). Enzima HRP transformă substratul DAB într-un precipitat maroniu care se depune în țesut la locul reacției, producând astfel o reprezentare vizuală a locului în care anticorpul primar s-a legat pentru prima dată de ținta sa.
Tehnologie
Prepararea țesuturilor
Tesutul joacă un rol central în experiment și este important ca acesta să fie prelucrat astfel încât să se păstreze epitopii și morfologia corespunzătoare. Cea mai frecventă prelucrare pentru IHC este pregătirea blocurilor de țesut fixate în formol și încorporate în parafină (FFPE). Scopul fixării în formol este de a produce reticulația chimică a proteinelor din țesut. Acest lucru pune capăt tuturor proceselor celulare și îngheață componentele celulare la locul și în conformația în care se aflau în momentul fixării și previne, de asemenea, degradarea. După o fixare adecvată, țesutul este prelucrat în continuare și, în cele din urmă, încorporat în blocuri de parafină, care sunt apoi secționate în felii subțiri (de obicei, 4-10 µm) cu ajutorul unui microtometru. Secțiunile sunt transferate pe lame de sticlă și se lasă să adere înainte de prelucrarea ulterioară.
Se folosesc uneori și alte metode de fixare în afară de formol. Acestea includ alte tipuri de aldehide sau utilizarea unor soluții alcoolice diferite. Cea mai bună alegere a fixatorului depinde foarte mult de analiză. O alternativă obișnuită la FFPE este pregătirea probelor de țesut congelate. În acest caz, țesutul este încorporat într-un mediu crioprotector și congelat, iar fixarea se realizează după secționare. Țesuturile congelate sunt secționate în criostate și au avantajul unor timpi de procesare scurți și al unei mai bune conservări a epitopilor sensibili, dar pot fi adesea inferioare țesuturilor FFPE în ceea ce privește conservarea morfologiei histologice.
Recuperarea antigenului (epitopului)
O preocupare asociată cu fixatorii de reticulare, cum ar fi formalina, sau cu timpul prea îndelungat petrecut în mediul fixator este mascarea epitopilor, care poate împiedica anticorpul primar să se lege de ținta sa. În special în cazul probelor FFPE, este adesea necesar să se inverseze o parte din reticulația chimică și să se „recupereze” epitopii înainte de a trece la IHC propriu-zisă. Sunt disponibile mai multe protocoale de recuperare a antigenului, iar principalele strategii includ tratarea lamei de țesut cu căldură, enzime digestive, detergenți sau combinații ale acestora. Cea mai comună metodă de recuperare a antigenului în probele FFPE este fierberea sub presiune a lamelelor de țesut într-un tampon citrat acid timp de aproximativ 15-20 de minute.
Legatura anticorpilor
Calitatea și specificitatea moleculei de legare este crucială pentru orice tehnică bazată pe IHC, iar alegerea liantului poate afecta în mod direct rezultatul, fiabilitatea și, eventual, și interpretarea testului. Anticorpii sunt, de departe, cel mai frecvent tip de moleculă de legare utilizată pentru IHC și, deși majoritatea anticorpilor sunt capabili să detecteze în mod adecvat molecula corectă de interes, aceștia pot, de asemenea, să varieze foarte mult în ceea ce privește specificitatea lor pentru ținta dorită. Prin urmare, anticorpii cu o specificitate ridicată sunt mai fiabili atunci când se interpretează legarea „la țintă”, deoarece aceștia produc o legare „în afara țintei” sau „fond” redusă sau inexistentă. Anticorpii care sunt mai puțin specifici pot produce mai multe legături în afara țintei, iar fundalul rezultat poate interfera cu interpretarea corectă a adevăratelor semnale „on-target”. Există două tipuri principale de anticorpi: anticorpi policlonali, care reprezintă un amestec eterogen de anticorpi care se leagă de diferiți epitopi de pe țintă, și anticorpi monoclonali care se leagă toți de același epitop. Anticorpii policlonali sunt adesea foarte puternici datorită capacității lor de a detecta și de a lega mai mulți epitopi pe aceeași țintă. Cu toate acestea, epitopii pe care îi leagă sunt adesea slab definiți și, odată cu specificitatea epitopică multiplă și variabilă, crește probabilitatea apariției evenimentelor de legare în afara țintei și a zgomotului de fond. Cu toate acestea, potența anticorpilor policlonali poate fi avantajoasă, deoarece concentrația de evenimente de legare în jurul moleculei țintă depășește, de obicei, potențialul zgomot de fond. Un dezavantaj este faptul că anticorpii policlonali sunt, de obicei, resurse limitate, deoarece sunt derivați din seruri animale. Anticorpii monoclonali, în schimb, au mai multă continuitate, deoarece pot fi produși în linii celulare de hibridom. Anticorpii monoclonali sunt, de asemenea, adesea bine definiți în ceea ce privește legarea epitopului, dar pot genera totuși rezultate greu de interpretat dacă specificitatea este scăzută sau dacă epitopul țintă este prezent în abundență redusă.
Este necesară o optimizare și o titrare atentă a concentrației de anticorpi pentru fiecare test, deoarece rezultatul depinde nu numai de specificitatea și afinitatea anticorpului pentru țintă, ci și de concentrația și disponibilitatea epitopilor on-target și a potențialilor epitopi off-target prezenți în probă. Adăugarea unei cantități prea mari de anticorpi în probă va crește numărul de posibile evenimente de legare cu afinitate scăzută în afara țintei, odată ce epitopul (epitopii) pe țintă sunt saturați de lianți. Prin scăderea concentrației de anticorpi, evenimentele de legare în afara țintei devin mai rare, deoarece acestea au de obicei o afinitate mai mică decât evenimentele de legare pe țintă. Riscul atunci când se încearcă reducerea fondului în timp ce se utilizează un anticorp cu afinitate scăzută este acela că semnalele pe țintă sunt concomitent slăbite până la punctul de a furniza un rezultat fals negativ.
Alte tipuri de molecule de legare utilizate uneori în tehnicile bazate pe IHC includ afibodii, peptide, fragmente de anticorpi sau alte molecule mici.
Sisteme de detecție
Scopul realizării IHC este acela de a obține o reprezentare vizuală a locului în care ținta poate fi găsită în țesutul experimental și, de preferință, de a obține, de asemenea, informații despre modelul de expresie al țintei în rândul populațiilor celulare eterogene și/sau localizări subcelulare. Acest lucru este exemplificat în figura 2, care ilustrează modul în care sunt utilizați diferiți anticorpi pentru a vizualiza diferite compartimente celulare sau tisulare în cadrul unui țesut complex. Pentru a vizualiza interacțiunea țintă-anticorp, este necesar un anumit tip de sistem de detecție care să producă o colorație sau un semnal observabil. Cea mai frecventă metodă de introducere a unui sistem de detecție în experiment este utilizarea unui anticorp secundar care poartă o moleculă reporter legată în prealabil, de exemplu, o enzimă sau un fluorofor. Anticorpii secundari sunt, de obicei, direcționați în mod specific către moleculele de anticorpi de la o specie animală diferită. De exemplu, dacă anticorpul primar este crescut la un iepure, atunci anticorpul secundar trebuie să fie crescut la un alt animal și să vizeze în mod specific anticorpii de iepure.
| Esofagus | Magnificare | |||
|---|---|---|---|---|
| Colorație cu hematoxilină | Nici o colorare cu anticorpi | |||
| TP63 CAB000083 |
Colorare nucleară | |||
| . EGFR CAB000035 |
Membranous staining | |||
| G6PD HPA000247 |
Tignificare citoplasmatică | |||
| LAMB2 (Laminin) CAB000053 |
Tesut conjunctiv |
Figura 2. Vizualizarea diferitelor ținte proteice în țesuturile complexe. Coloana din dreapta prezintă o mărire a imaginilor corespunzătoare din coloana din stânga.
În imaginea IHC (figura 2), secțiuni consecutive de esofag uman colorate cu patru anticorpi diferiți permit compararea directă a diferitelor modele de expresie a proteinelor în cadrul țesutului și în cadrul compartimentelor subcelulare. Imaginile de sus sunt contracolorate doar cu hematoxilină pentru comparație. Anticorpul p63 colorează nucleele celulare într-o populație de celule care rezidă în partea bazală a epiteliului esofagian. Anticorpul EGFR (receptorul factorului de creștere epidermică) pare să coloreze aceeași populație celulară ca și p63, dar colorează membranele celulare în loc de nuclee. Anticorpul G6PD (glucoză-6-fosfat dehidrogenază) colorează citoplasma unui repertoriu mai larg de celule epiteliale esofagiene și, de asemenea, a celulelor care rezidă în țesutul conjunctiv. Anticorpul Laminin (LAMB2) colorează numai celulele și structurile din țesutul conjunctiv care stau la baza esofagului.
Pentru probele de țesut FFPE, cea mai frecventă metodă de detecție este utilizarea reacțiilor enzimatice pentru a genera un precipitat colorat la locul de legare a anticorpilor. Anticorpii secundari transportă apoi o enzimă, de exemplu, peroxidaza de hrean (HRP) sau fosfataza alcalină (AP), care sunt capabile să transforme cromogeni precum 3,3′ diaminobenzidina (DAB) sau fosfatul de 5-bromo-4-cloro-3-indolil/ clorura de tetrazoliu p-nitro-albastru (BCIP/NBT) în precipitate brune sau albăstrui care se depun în țesut la locul reacției. Coloranții cromogeni sunt observabili în microscopia de lumină și sunt, de obicei, foarte stabili pe perioade lungi de timp, ceea ce este benefic dacă experimentul trebuie să fie arhivat sau revizuit la un moment ulterior.
Pentru secțiunile de țesut congelate este mai frecventă utilizarea anticorpilor secundari legați de fluorofori care emit o culoare specifică (de obicei verde, roșu sau albastru) atunci când sunt excitați de lungimile de undă de lumină corespunzătoare. În plus, fluoroforii nu sunt de obicei stabili pentru perioade lungi de timp. Cu toate acestea, avantajul utilizării fluoroforilor constă în faptul că aceștia oferă o metodă ușoară de realizare a experimentelor de dublă marcare, în care mai mulți anticorpi împotriva mai multor ținte sunt analizați în aceeași probă. Anticorpii secundari trebuie să fie direcționați către diferiți anticorpi primari și, de asemenea, să fie cuplați la diferiți fluorofori. Diferiți anticorpi secundari sunt apoi observați separat prin excitarea lor secvențială cu diferite lungimi de undă de lumină. Aceste rezultate diferite de excitare sunt salvate ca imagini separate (sau canale de culoare) și pot fi suprapuse ulterior pentru a deduce colocalizările proteinelor etc.
Utilizarea anticorpilor secundari purtători de raportori pentru detecție este în sine o etapă de amplificare, deoarece mai mulți anticorpi secundari sunt capabili să se lege de un singur anticorp primar, dar uneori se doresc etape suplimentare de amplificare pentru a crește semnalul și sensibilitatea experimentului. În astfel de cazuri, anticorpul secundar poate purta în schimb „molecule de legătură”, de exemplu polimeri de biotină, care sunt capabili să recruteze un număr mai mare de molecule reporter în etapele ulterioare. Această strategie de amplificare a semnalelor este utilă atât pentru metodele de detecție enzimatică, cât și pentru cele fluorescente.
Contracolorare
Colorarea imunohistochimică care utilizează cromogeni beneficiază adesea de aplicarea unui contracolorant care sporește contrastul și facilitează observarea caracteristicilor histologice. Cel mai frecvent tip de contracolorant utilizat pentru probele FFPE este hematoxilina care colorează citoplasma celulară cu o culoare albăstruie palidă și colorează nucleele celulare într-o nuanță albăstruie mai închisă. Colorațiile fluorescente nu sunt de obicei contracolorate cu hematoxilină, deoarece metoda de detecție nu se bazează pe microscopia optică. În schimb, cea mai frecventă modalitate de a obține contracolorarea pentru fluorescență este marcarea nucleelor celulare prin adăugarea de coloranți fluorescenți care se leagă de acizi nucleici. După reacția imunohistochimică propriu-zisă, singurele etape rămase sunt acoperirea și sigilarea probei pentru protecție și depozitare pe termen lung. Cea mai comună modalitate este de a „lipi” capacul de probă cu ajutorul unor rășini disponibile în comerț, fabricate special.
Exemple specifice
IHC este utilizată pe scară largă atât în cercetare, cât și în practica clinică. Proiectul Human Protein Atlas (HPA) este un prim exemplu al modului în care IHC de mare capacitate este utilizat pentru a realiza o cartografiere pe scară largă a proteomului uman într-o multitudine de țesuturi, cancere și celule. În cadrul proiectului HPA, un lanț intern raționalizat de producție de anticorpi pe scară largă facilitează generarea de anticorpi specifici, care, după ce trec prin regimuri de caracterizare și validare de bază, sunt utilizați pentru a colora sistematic microrețele de țesuturi care conțin sute de nuclee de țesut în cadrul unui singur experiment. Sistemul pentru IHC utilizat de HPA se bazează în mare măsură pe standardizarea protocoalelor și pe automatizarea cu ajutorul mașinilor, dar evaluarea titrării optime pentru fiecare anticorp se realizează manual înainte ca anticorpul să fie aprobat pentru colorarea pe setul complet de țesuturi. Fiecare nucleu de țesut colorat este adnotat în ceea ce privește colorarea imunohistochimică în țesuturi și tipuri de celule, iar ulterior este publicat ca imagine de înaltă rezoluție pe portalul web pentru a fi vizualizat liber de oricine.
În practica clinică, IHC este utilizată în principal în cadrul patologiei pentru a ajuta medicii să evalueze specimenele de țesut în ceea ce privește starea sănătoasă și sau bolnavă, pentru a stabili diagnostice și pentru a defini subtipul molecular al diferitelor tipuri de cancer. Un exemplu specific în care IHC este utilizat în scopuri diagnostice este atunci când patologilor li se prezintă o mostră de tumoare metastatică și nu se cunoaște originea tisulară a tumorii primare. În aceste cazuri, patologii utilizează un panou de anticorpi diferiți care vizează proteine specifice țesutului, cum ar fi antigenul specific prostatic pentru cancerul de prostată, sau receptorul de estrogen pentru cancerele ginecologice, sau citokeratina 20 pentru cancerele gastrointestinale (Gremel et al., 2014). Odată realizată o clasificare amplă, se utilizează anticorpi suplimentari specifici țesuturilor pentru a preciza și mai mult originea tumorii primare. Aceste informații sunt utile pentru a alege cea mai bună sau cea mai potrivită strategie pentru terapia medicamentoasă și/sau pentru a localiza tumora primară pentru radioterapie și/sau intervenție chirurgicală.
Referințe și link-uri
Anticorpi utilizați în mod obișnuit pentru diagnosticarea cancerului:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopatologie. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
A review on validating antibodies for IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014..03.008
Antibodypedia – O bază de date cu acces deschis a anticorpilor disponibili public și utilitatea lor în diverse aplicații:
IHC world – Protocols, Forum, Products, and more:
Un clip YouTube care ilustrează IHC de la BioGenexLaboratories:
.