Gertrude Stein s-a născut în Allegheny, Pennsylvania, la 3 februarie 1874, din imigranți evrei germani înstăriți. La vârsta de trei ani, familia ei s-a mutat mai întâi la Viena și apoi la Paris. S-au întors în America în 1878 și s-au stabilit în Oakland, California. Mama ei, Amelia, a murit de cancer în 1888, iar tatăl ei, Daniel, a murit în 1891.
Stein a urmat cursurile Radcliffe College din 1893 până în 1897, unde s-a specializat în psihologie sub conducerea cunoscutului psiholog William James. După ce a părăsit Radcliffe, s-a înscris la Universitatea Johns Hopkins, unde a studiat medicina timp de patru ani, pe care a părăsit-o în 1901. Stein nu a primit o diplomă oficială de la niciuna dintre cele două instituții.
În 1903, Stein s-a mutat la Paris cu Alice B. Toklas, o prietenă mai tânără din San Francisco, care avea să-i rămână parteneră și secretară pe tot parcursul vieții. Cuplul nu s-a mai întors în Statele Unite timp de peste treizeci de ani. În timpul Primului Război Mondial, s-au oferit voluntari împreună, conducând provizii către spitalele din Franța.
Împreună cu Toklas și cu fratele ei Leo, critic de artă și pictor, Stein a luat un apartament pe malul stâng. Casa lor, 27 rue de Fleurus, a devenit în curând un loc de întâlnire pentru mulți tineri artiști și scriitori, printre care Henri Matisse, Ezra Pound, Pablo Picasso, Max Jacob și Guillaume Apollinaire.
Era o susținătoare pasionată a „noului” în artă, iar prieteniile ei literare au crescut și au inclus scriitori atât de diferiți precum William Carlos Williams, Djuana Barnes, F. Scott Fitzgerald, James Joyce și Ernest Hemingway. Lui Hemingway i-a fost adresat faptul că Stein a inventat sintagma „generația pierdută” pentru a-i descrie pe scriitorii expatriați care trăiau în străinătate în perioada dintre războaie.
Până în 1913, sprijinul lui Stein pentru pictorii cubiști și scrisul ei din ce în ce mai avangardist au provocat o despărțire de fratele ei Leo, care s-a mutat la Florența. Prima ei carte, Trei vieți, a fost publicată în 1909. A urmat-o cu Tender Buttons (Claire Marie) în 1914.Tender Buttons arată în mod clar efectul profund pe care pictura modernă l-a avut asupra scrisului ei. În aceste mici poeme în proză, imaginile și frazele se întâlnesc în moduri adesea surprinzătoare – asemănătoare în manieră cu pictura cubistă. Scrisul ei, caracterizat prin folosirea cuvintelor pentru asociațiile și sunetele lor mai degrabă decât pentru înțelesurile lor, a primit un interes considerabil din partea altor artiști și scriitori, dar nu a găsit un public larg.
Printre cele mai influente lucrări ale lui Stein se numără The Making of Americans (1925); How to Write (1931); The Autobiography of Alice B. Toklas (1933), care a fost un best-seller; și Stanzas in Meditation and Other Poems (1956). Sherwood Anderson, în introducerea la Geography and Plays (1922), a scris că scrierile ei „constau într-o reconstrucție și o întreagă refacere nouă a vieții, în orașul cuvintelor.”
Stein a murit la Spitalul American din Neuilly la 27 iulie 1946, din cauza unui cancer inoperabil.
.