dNTP înseamnă trifosfat de nucleotidă deoxiriboză utilizat în PCR pentru a extinde șirul de ADN în creștere. dATP, dTTP, dGTP și dTTP sunt patru dNTP-uri comune utilizate în PCR.
Funcția dNTP-urilor în PCR este de a extinde șirul de ADN în creștere cu ajutorul Taq ADN polimerazei. Acesta se leagă de șirul de ADN complementar prin legături de hidrogen.
PCR este o tehnică in vitro de sinteză a ADN-ului. Scopul efectuării PCR este de a genera mai multe copii ale fragmentelor de ADN de care ne interesează pentru a le vizualiza sub electroforeză pe gel.
Obiectivul PCR este de a realiza milioane de copii de ADN pentru diverse aplicații în aval, cum ar fi secvențierea ADN sau microarray de ADN.
Reacția în lanț a polimerazei este instrumentul de neegalat utilizat în cercetarea genetică moleculară încă de la descoperirea sa. Șablonul de ADN, amorsele, tamponul, polimeraza Taq ADN și dNTP-urile sunt ingredientele PCR. Pentru a înțelege mecanismul PCR, ar trebui să învățăm importanța fiecărui ingredient utilizat în ea,
În acest articol, Discutăm despre unul dintre ingredientele cheie ale PCR, care este dNTP-urile. Vom analiza, de asemenea, structura acestuia și de ce este atât de important.
În plus, vom vorbi, de asemenea, despre mecanismul de interacțiune dintre dNTP-uri și Taq ADN polimeraza și despre modul lor de lucru asupra șuviței de ADN în creștere.
În plus, vom vorbi despre mecanismul prin care dNTP-urile și ADN polimeraza interacționează și ajută la creșterea șuviței de ADN.
Citește în continuare articolele legate de PCR,
- Rolul DMSO în PCR: DMSO un potențator al PCR
- Funcția taq ADN polimerazei în PCR
- Cadru de proiectare a amorselor PCR
- Rolul MgCl2 în reacția PCR
Subiecte cheie:
Ce sunt dNTP-urile?
DNTP-urile sunt nucleotidele artificiale folosite în PCR pentru a sintetiza noi șiruri de ADN, la fel ca în cazul replicării ADN-ului. dATP, dTTP, dGTP, dTTP sunt nucleotide comune prezente în mastermixul PCR.
Structura dNTP-urilor:
DNTP reprezintă trifosfat de nucleotidă deoxiriboză.
În primul rând, trebuie să înțelegem câteva terminologii de bază, cum ar fi bază, nucleotide, nucleozide, ribonucleotide, dezoxiribonucleotide, dideoxi ribonucleotide pentru a înțelege dNTP-urile. Aceștia sunt câțiva termeni de bază utilizați în mod obișnuit în genetică, dar totuși, oamenii i-au înțeles greșit.
Adenina și Guanina sunt baze purinice, în timp ce Citosina și Timina sunt baze pirimidinice. Bazele azotate nu pot forma direct ADN. Coloana vertebrală fosfatică și zahărul pentoză sunt necesare în plus pentru a crea o moleculă de ADN.
Nucleotidul este alcătuit dintr-un zahăr pentozic, un fosfat și o bază azotată. O nucleotidă se leagă de o altă nucleotidă adiacentă cu ajutorul legăturii fosfodiester, în timp ce o nucleotidă se leagă de o altă nucleotidă de pe catena opusă a ADN-ului cu ajutorul legăturilor de hidrogen.
Imaginea reprezintă structura trifosfatului, difosfatului și monofosfatului de deoxiriboză.
Citește mai departe despre structura ADN-ului: Povestea ADN-ului: Structura și funcția ADN-ului
Fosfatul prezent în nucleotidă este trifosfat, (tri-trei) atunci când fosfatul nu este legat de nucleotidă (sau este absent), se numește nucleozidă (nucleotida fără fosfat se numește nucleozidă).
Când un atom de hidrogen înlocuiește grupa hidroxil în zahărul pentoză, zahărul se numește zahăr dezoxi. ADN-ul este alcătuit din zahăr dezoxi pentoză, în timp ce ARN-ul este alcătuit doar din zahăr riboză.
DNTP-urile sunt lanțul de nucleotide alcătuit din riboză, bază azotată și fosfat.
În continuare, ddNTP-urile sunt diferite de dNTP-uri.
Dideoxinucleotida trifosfat nu are grupa 3′ OH liberă, o altă grupă 3′ OH a zahărului este înlocuită cu hidrogen.
În consecință, nu poate provoca expansiunea unui lanț de ADN în creștere. Așadar, aceste tipuri de ddATP, ddTTP, ddCTP și ddGTP sunt utilizate în secvențierea ADN. Vom discuta în detaliu rolul ddNTP-urilor în secvențiere într-un alt articol.
DddNTP-urile sunt folosite în metoda de terminare a lanțului pentru a opri expansiunea sintezei ADN.
Imaginea reprezintă diferența dintre zahărul riboză, zahărul dezoxiriboză și zahărul dezoxiriboză.
Trifosfatul este alcătuit din trei molecule diferite de fosfat care asigură o coloană vertebrală pentru ADN.
Spina vertebrală de fosfat a ADN-ului are trei molecule diferite de fosfat numite fosfat alfa, beta și gamma. Când se eliberează un singur fosfat sau fosfat gamma, structura se numește dezoxinucleotid difosfat.
În mod similar, când se eliberează doi din cei trei fosfați, structura se numește dezoxinucleotid monofosfat.
dATP și dGTP sunt purine, în timp ce dCTP și dTTP sunt dNTP-uri pirimidinice utilizate în reacția PCR. Funcția dNTP-urilor în PCR este aceeași cu cea a replicării in vivo. Dacă sunteți interesat să citiți diferențele dintre nucleotide vs. nucleozide și purine vs. pirimidine, citiți aceste articole:
- Purine vs pirimidine
- Nucleotide vs nucleozide
Imaginea reprezintă patru structuri diferite ale dNTP-urilor.
Funcția dNTP-urilor:
DNTP-urile sunt ingredientele PCR, RT-PCR, secvențierea ADN sau microarray de ADN care ajută la creșterea ADN-ului sau la amplificarea ADN-ului.
Mecanism de acțiune:
Procesul PCR este împărțit în trei etape dependente de temperatură:
- Denaturare
- Annealing
- Extensie.
În etapa de denaturare, ADN-ul bicatenar este denaturat în ADN monocatenar; În etapa de recoacere, amorsa se leagă în poziția exactă în care este prezentă secvența sa complementară și,
În etapa de extensie, Taq ADN polimeraza adaugă dNTP-uri la nivelul catenei de ADN în creștere.
După ce șirul este deschis și amorsa se leagă de ADN monocatenar, Taq ADN polimeraza își începe activitatea catalitică.
Taq ADN polimeraza folosește ADN-ul monocatenar ca substrat pentru activitatea enzimatică și se stabilește la joncțiunea amorsă-ADN.
Unul dintre capetele Taq ADN polimerazei se leagă în apropierea grupului 3′ OH al amorselor oligonucleotidice, acest complex se numește complex P- ADN.
Imaginea reprezintă structura ADN-ului cu legături de hidrogen și legătura fosfodiester a ADN-ului.
În etapa următoare, a început adiția dNTP.
DNTP-ul se leagă de complexul P-ADN cu afinitate slabă dacă este prezentă nucleotida complementară exactă. La scurt timp după aceea, ADN polimeraza Taq îl reține și are loc interacțiunea de legătură de hidrogen între o bază complementară și dNTP.
Aici, la început, nu întregul nucleotid, ci baza (baza azotată) prezentă pe dNTP decide dacă se leagă sau nu.
În primul rând, dacă găsește baza complementară pe șablonul ssADN (A pentru T și G pentru C), va forma legături de hidrogen între ele. Se fabrică trei legături de hidrogen între C și G și două legături de hidrogen între A și T.
După ce se formează legătura de hidrogen, Taq ADN polimeraza conformează acea legătură a dNTP-ului cu șirul de ADN în creștere prin formarea unei legături fosfodiester. Acum, după formarea legăturii fosfodiester, Taq ADN polimeraza Taq se deplasează cu un pas înainte pentru adăugarea de noi dNTP.
Legătura fosfodiester se formează între 3′ OH al amorselor și 5′ P al dNTP-ului.
După formarea legăturii de hidrogen, Taq ADN polimeraza catalizează reacția prin îndepărtarea gamma și beta-fosfatului din trifosfatul dNTP-ului. După terminarea reacției se eliberează doi pirofosfați (PPi).
Cinetica exactă a modului în care interacționează dNTP-urile și Taq polimeraza în timpul reacției PCR nu este încă cunoscută.
Citește mai departe despre o electroforeză pe gel de agaroză,
- Electroforeza pe gel de agaroză
- Colorant de încărcare a gelului de ADN
- Rolul EtBr în electroforeza pe gel de agaroză
Concentrația dNTP-urilor în PCR:
În general, pentru reacția PCR cu 30 până la 35 de cicluri de execuție, sunt suficiente 200μM din fiecare dNTP.
200μM fiecare, ceea ce înseamnă că într-o singură reacție PCR se utilizează în total 800μM din 4 amestecuri de dNTPs. Trebuie să ne pregătim concentrația de lucru din soluția stoc de 100mM.
Cu toate acestea, în ultimele zile, mastermixul gata de utilizare este foarte popular și eficient. Mastermixul gata de utilizare conține toate ingredientele importante, cum ar fi amestecul dNTPs, colorantul de încărcare a gelului și ADN polimeraza Taq.
Cum suntem studenți la științe, trebuie să ne gândim cum să preparăm soluția de lucru din stoc. Să presupunem că trebuie să preparăm 2mM de lucru din 100mM de stoc.
Acum,
Îți amintești V1C1= V2C2?
Aici, concentrația dată C1 este 100mM (care este concentrația stocului de dNTPs)
V1 este volumul dat este necunoscut (?)
C2 este concentrația necesară = 2mM
V2 este volumul necesar= 1000μL
Acum V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Aici, 20μL din fiecare dNTP necesar pentru prepararea soluției de lucru, astfel încât volumul final pentru amestecul nostru este de 80μL de (dATP, dCTP, dGTP și dTTP) în 920μL de D/W.
Aceasta va face ca concentrația finală să fie de 2mM din fiecare dNTP în 1000μL de soluție de lucru. Calculați singur pentru 200μM.
Ghidul meu final pentru utilizarea dNTP-urilor în PCR
Preparați întotdeauna două tuburi de soluție stoc și păstrați toate tuburile la -20°C.
Calculați câte reacții efectuați într-o săptămână, în consecință pregătiți soluția de lucru din soluția stoc și păstrați-o la 4°C. Deoarece congelarea și decongelarea repetată vor scădea activitatea dNTP-urilor.
Purtați întotdeauna briliante și mențineți condițiile de sterilitate în timpul preparării soluției de lucru, deoarece contaminarea cu ADN străin va îngreuna reacția PCR.
Concentrația de 200μM este suficientă pentru reacția PCR, cu toate acestea, pentru PCR cu rază lungă de acțiune se poate folosi o concentrație de 2mM până la 3 mM din fiecare dNTP.
Cu cât crește concentrația de dNTP-uri, rata de legare nespecifică va crește. În mod similar, raritatea dNTP-urilor conduce la produse PCR incomplete. Deci, folosiți întotdeauna o cantitate adecvată de dNTPs.
Concluzie:
În concluzie, Funcția dNTP-urilor în reacția PCR este la fel de importantă ca și cea a ADN polimerazei Taq.
Cu ajutorul Taq, dNTP-urile se leagă de șirul de ADN în creștere și îl extind. Dacă nu doriți să vă încurcați cu toate aceste lucruri, puteți folosi kitul PCR gata de utilizare, care este mai preferabil. Cu toate acestea, trebuie să învățați metoda manuală de preparare a reactivilor.
.