Frontiers in Oncology

Introducere

Se știe că infecția persistentă cu papilomavirusul uman cu risc înalt (hr-HPV) este o cauză necesară pentru cancerul de col uterin și leziunile precanceroase (1, 2). Cu o etiologie dezvăluită, cancerul de col uterin este foarte ușor de prevenit (3, 4). Țările dezvoltate au început să utilizeze testarea hr-HPV în depistarea primară a cancerului de col uterin, fie singură, fie în co-testare cu citologia (5-8). Dovezile arată că programele de screening bazate pe HPV oferă o protecție mai mare împotriva precancerului și cancerului de col uterin decât alte metode tradiționale de screening, cum ar fi citologia (9-11). Cu toate acestea, deoarece majoritatea infecțiilor cu HPV ar putea fi eliminate spontan, testarea HPV identifică numeroase infecții care nu vor evolua spre precancer sau cancer de col uterin, în special la femeile tinere (12). Prin urmare, testarea HPV ADN nu este recomandată pentru depistarea femeilor cu vârsta sub 30 de ani. Mai mult, pacientele HPV-pozitive direcționate pentru proceduri ulterioare pot suferi intervenții invazive inutile.

În China, în 2015, au existat 98 900 de cazuri noi și 30 500 de decese cauzate de cancerul de col uterin (13). Pentru a frâna tendința de creștere a acestei malignități, guvernul chinez a oferit un program național gratuit de screening pentru cancerul de col uterin pentru femeile care trăiesc în zonele rurale începând cu 2009, utilizând VIA/VILI, testul Papanicolau (Papanicolau) sau testul HPV (în locațiile pilot), în funcție de nivelurile de dezvoltare economică și tehnologică (14). Cu toate acestea, datorită naturii acestor metode de screening, acuratețea diagnosticului trebuie să fie îmbunătățită. În plus, având în vedere populația mare a Chinei, ar trebui evaluat un nou instrument de screening cu un echilibru între sensibilitate și specificitate.

Markerii moleculari specifici bolii de cancer de col uterin oferă o combinație de sensibilitate ridicată și specificitate ridicată pentru a detecta precancerul cervical. Cei mai mulți dintre acești markeri au fost identificați pe baza mecanismului de carcinogeneză legat de HPV. Testarea HPV ARN se bazează pe detectarea ARNm HR-HPV E6 și E7. Potențialul oncogen al infecției cu HPV depinde de producția de oncoproteine virale E6/E7. Astfel, detectarea transcriptelor ARNm E6/E7 oferă posibilitatea unui test specific pentru detectarea leziunilor precanceroase.

În acest studiu, am evaluat performanța clinică a testului ARNm HPV E6/E7 pentru detectarea neoplaziei intraepiteliale cervicale de grad înalt (CIN) și a cancerului în rândul femeilor chineze.

Materiale și metode

Participante și proceduri

Acest studiu bazat pe spital a fost efectuat în perioada aprilie-decembrie 2017 în provincia Henan, China. Au fost invitate femeile care au vizitat departamentul de ginecologie al The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) pentru colposcopie. Criteriile de includere au fost următoarele: (1) femei cu vârste cuprinse între 25 și 64 de ani; (2) fără antecedente de cancer de col uterin sau histerectomie; (3) fără simptome clinice de sarcină sau la 8 săptămâni după întreruperea sarcinii; și (4) să înțeleagă procedurile studiului și să participe în mod voluntar. Studiul a fost aprobat de către Comitetul de evaluare instituțională (IRB) al Spitalului de Cancer Henan (HCH). Consimțământul în cunoștință de cauză scris a fost obținut de la fiecare participant.

Celulele cervicale exfoliate au fost obținute de la femei în timpul examenului ginecologic. Specimenul a fost conservat în 20 ml de mediu de transport PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, Statele Unite) și depozitat la 4°C. Apoi, examinarea colposcopică a fost efectuată de un ginecolog. Femeile cu rezultate anormale la colposcopie au fost supuse unei biopsii orientate pe leziuni. În cazul în care examinarea colposcopică a fost nesatisfăcătoare (joncțiunea scuamocolumbiană nu a fost complet vizibilă), s-a efectuat un chiuretaj endocervical (ECC). Specimenele de celule cervicale exfoliate au fost transportate la Institutul și Spitalul de Cancer, Academia Chineză de Științe Medicale (CICAMS). Specimenele au fost împărțite în două porțiuni: un amestec de celule de 1,5 ml într-un tub EP pentru testul HR-HPV ADN și testul HPV E6/E7 mRNA. Prezervativul rezidual cu celule exfoliate a fost utilizat pentru testul citologic ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Statele Unite). Sistemul de raportare Bethesda a fost utilizat pentru citologie de către un citolog senior (15).

Dezvoltarea ADN-ului HPV-HR

Eșantioanele de 400 μl de amestec celular din tuburi EP de 1,5 ml au fost utilizate pentru detectarea ADN-ului a 14 tipuri de HPV-HR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 și 68) prin testul Cobas 4800 HPV (Roche, Basel, SUI). Acesta a raportat rezultatul combinat al celor 14 hrHPV și rezultatul separat pentru HPV 16 și 18, simultan (16). Cobas 4800 a fost un test bazat pe PCR pentru ADN HPV cu amplificare prin hibridizare a acidului nucleic, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. În fiecare test au fost stabilite controale de calitate negative și pozitive. În cazul în care valoarea ct a fost mai mare de 40, rezultatul a fost considerat ca fiind negativ. În caz contrar, rezultatul a fost considerat pozitiv. Rezultatele pozitive au inclus trei tipuri: HPV 16, HPV 18 și HPV altele (31, 33, 35, 35, 39, 45, 51, 52, 52, 56, 58, 59, 66 și 68).

Testarea ARNm HPV E6/E7

Pentru detectarea ARNm viral E6/E7 de la tipurile de HPV de 14 ore au fost utilizate probe de un ml din tuburi EP de 1,5 ml pentru detectarea ARNm viral E6/E7 din tipurile de HPV de 14 ore în testul APTIMA HPV agregat (Hologic Inc, Marlborough, MA, Statele Unite), în conformitate cu instrucțiunile producătorului (17). A fost un test în trei etape, incluzând extracția ARNm, amplificarea și detectarea produsului amplificat. În cazul în care numărul de copii a fost mai mare sau egal cu 1,0, rezultatul a fost considerat pozitiv. În caz contrar, rezultatul a fost negativ.

Diagnostic histopatologic

Tesuturile de biopsie și ECC au fost trimise la SAHZU pentru diagnosticul histopatologic în conformitate cu sistemul de raportare a neoplaziei intraepiteliale cervicale (CIN). Apoi, histopatologii de la HCH au examinat toate lamelele. Orice diagnostic patologic inconsecvent a fost trimis la CICAMS pentru adjudecare. Diagnosticul final pentru fiecare femeie s-a bazat pe cea mai proastă citire de la revizuirea panelului. Toate procesele de depistare și diagnosticare au fost oarbe.

Analiză statistică

Diagnosticul histopatologic final a fost folosit ca standard de aur. Femeile cu diagnosticul TCT de leziune intraepitelială scuamoasă de grad scăzut (LSIL) sau mai rău (LSIL +) au fost considerate ca fiind pozitive la citologia pe bază de lichid (LBC). Rezultatele ADN HPV au fost stratificate, în funcție de tipurile de HPV: HPV16/18 (adică HPV16 și/sau HPV18 pozitiv), HPV-alții (adică oricare dintre cele 12 tipuri de HPV-HPV pozitive, cu excepția HPV16 și HPV18) și HPV-total (adică oricare dintre cele 14 tipuri de HPV-HPV pozitive). S-au calculat estimările absolute și intervalele confidențiale de 95% (95%CI) ale ratelor pozitive, sensibilității, specificității, valorii predictive pozitive (PPV) și valorii predictive negative (NPV). Diferențele de expresie a ARNm HPV în diferite grupuri de HPV au fost calculate cu ajutorul testului chi pătrat sau al testului exact al lui Fisher. Testul McNemar a fost utilizat pentru a identifica diferențele de sensibilitate și specificitate. Nivelul α a fost stabilit la 0,05, iar p < 0,05 (de două dimensiuni) a fost considerat ca fiind semnificativ din punct de vedere statistic.

Rezultate

În total, 537 de femei au fost incluse în această analiză. Vârsta medie a fost de 43,88 ± 10,97 ani. Diagnosticele LBC au fost: 183 (34,7%) normal, 135 (25,1%) celule scuamoase atipice de semnificație nedeterminată (ASC-US), 22 (4,1%) celule scuamoase atipice nu pot exclude HSIL (ASC-H), 7 (1.3%) celulă glandulară atipică (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt (HSIL), 31 (5,8%) carcinoame cu celule scuamoase (SCC) și 2 (0,4%) adenocarcinom in situ (AIS). Diagnosticele histopatologice au fost 298 (55,5%) normale, 30 (5,6%) neoplazie intraepitelială cervicală de gradul 1 (CIN1), 48 (8,9%) CIN2, 111 (20,7%) CIN3, 43 (8,0%) SCC și 7 (1,3%) AIS.

Tabelul 1 a arătat corelația dintre detectarea ARNm și ADN în funcție de tipurile de HPV. Acordul total al celor două teste a fost de 90,7% (95%CI: 87,9, 92,9) cu o valoare kappa de 0,81. Ratele pozitive ale ARNm au fost de 91,7 %, 84,6 % și 86,4 % la femeile pozitive la HPV16/18, HPV-alții și, respectiv, HPV-total. Toate ratele pozitive la ARNm au fost mai mari la femeile HPV-pozitive decât la femeile HPV-negative din același grup de tip HPV (toate p < 0,001).

Ratele HPV ADN, ARNm și LBC pozitive au crescut odată cu severitatea diagnosticului histopatologic, au variat de la 25,5, 19,1 și 11,4% în cazul normalului până la 100,0% în cazul SCC, respectiv. Ratele pozitive ale celor trei teste în AIS au fost de 85,7, 85,7 și, respectiv, 100,0%. Aceste trei teste au avut rate pozitive similare în CIN3, SCC și AIS. Dar ratele pozitive ale ARNm au fost relativ mai mici la femeile cu diagnosticul CIN2. Ratele de HPV16 pozitive au fost cele mai ridicate în CIN3, SCC și AIS în comparație cu alte grupuri de ADN HPV. Ratele HPV18 pozitive au fost mai mici de 7% în toate leziunile cu celule scuamoase, dar puțin mai mari (28,6%) în AIS (Tabelul 2).

Tabelul 3 a arătat performanța clinică a celor trei teste în detectarea leziunilor CIN2+ și CIN3+. Sensibilitatea ARNm pentru detectarea CIN2+ și CIN3+ a fost de 93,8% (95%CI: 89,7-96,4) și, respectiv, 95,7% (95%CI: 91,3-97,9), care nu au fost diferite de cele detectate de ADN (95,7% pentru CIN2+, 96,3% pentru CIN3+), dar mai mari decât cele detectate de LBC (80,4% pentru CIN2+ și 88,8% pentru CIN3+). Specificitățile pentru ARNm pentru detectarea CIN2+ (79,0% ) și CIN3+ (70,5% ) au fost semnificativ mai mari decât cele detectate prin ADN (71,0% pentru CIN2+, 62,8% pentru CIN3+) (p < 0,05), dar mai mici decât cele detectate prin LBC (84,5% pentru CIN2+, 79,8% pentru CIN3+). PPV-urile pentru ARNm pentru detectarea CIN2+ și CIN3+ au fost de 74,0% (95%CI: 68,4-78,9) și 58,1% (95%CI: 52,1-63,9), iar NPV-urile au fost de 95,2% (95%CI: 92,0-97,2) și, respectiv, 97,4% (95%CI: 94,8-98,8).

Tabelele 4, 5 au arătat ratele pozitive și performanța clinică a celor trei teste în diferite grupe de vârstă. Pe scurt, toate testele au prezentat performanțe mai bune pentru femeile cu vârsta peste 30 de ani decât pentru femeile mai tinere. Testul HPV ADN a avut cea mai mare sensibilitate, iar LBC a avut cea mai mare specificitate pentru detectarea CIN2+ și CIN3+ la femeile mai tinere de 30 de ani.

Discuție

Rezultatele prezentate au arătat că testul ARNm și tezaurul ADN au atins o concordanță ridicată de 90,7%. Ratele HPV ADN, ARNm și LBC pozitive au crescut odată cu severitatea diagnosticului histopatologic, de la 25,5, 19,1 și 11,4% în cazul diagnosticului normal la 100,0% în cazul SCC, respectiv. Sensibilitatea ARNm pentru detectarea CIN2 și CIN3+ a fost de 93,8% și 95,7%, care au fost similare cu cele detectate prin ADN (95,7% pentru CIN2+ și 96,3% pentru CIN3+). Dar specificitățile pentru ARNm (79,0% pentru CIN2+ și 70,5% pentru CIN3+) au fost semnificativ mai mari decât cele detectate de ADN (71,0% pentru CIN2+ și 62,8% pentru CIN3+).

În acest studiu, testul ARNm HPV E6/E7 și testul ADN HPV au prezentat o concordanță ridicată. Dintre acele femei HPV 16/18 ADN pozitive, 91,7 % au fost, de asemenea, pozitive la ARNm, ceea ce este similar cu alte studii, care au raportat o concordanță generală de peste 90 % între testul APTIMA HPV și testele HPV ADN (17, 18) și rate pozitive constant mai mari pentru testul HPV ADN în diferite populații (19, 20). Am observat rate pozitive mai mari la femeile mai în vârstă decât la femeile mai tinere, ceea ce a fost ușor diferit de alte studii (21-23). Această variație poate fi atribuită designului studiului (de exemplu, studiu bazat pe spital), care limitează extrapolarea constatărilor în populația generală. În mod interesant, rata de discordanță a fost mai mare la femeile cu vârsta de 30 de ani sau mai tinere (25,6% vs. 8,6%). Studiile au demonstrat o rată mai mare de eliminare spontană a infecției cu HPV la femeile mai tinere, ceea ce a indicat o posibilitate mai mică de integrare a HPV (24).

După cum știm, testele HPV bazate pe ADN detectează prezența sau absența ADN-ului HPV. Cu toate acestea, majoritatea infecțiilor cu HPV sunt tranzitorii, eliminate spontan în decurs de 1 an, care nu ar evolua spre precancer cervical sau cancer (25). Expresia ARNm E6/E7 apare numai în celulele infectate în mod activ și crește în timpul dezvoltării și progresiei CIN (26). Prin urmare, se presupune că testul HPV mRNA este mai specific în detectarea leziunilor cervicale de grad înalt. Datele noastre au confirmat această ipoteză. Am constatat că testul ARNm a fost la fel de sensibil ca și testul ADN, dar mai specific în detectarea precancerului și a cancerului cervical. Alți cercetători au ajuns la concluzii similare fie în screeningul primar (20), fie în triajul femeilor cu citologie anormală minoră (27). În studiul nostru, 50 de femei au avut rezultate discordante între testul ADN HPV și testul ARNm. Dintre acestea, 34 ADN + /ARNm- față de 8 ARNm + /ADN- au fost diagnosticate ca fiind normale sau CIN1; 6 față de 2 au fost diagnosticate ca fiind CIN2 sau CIN3; nicio diferență de test nu a fost observată în cazul cancerelor. Prin urmare, dacă înlocuim testul HPV ADN cu testul ARNm, 34 de femei nu ar fi direcționate pentru colposcopie inutilă, dar 4 CIN2 și 2 CIN3 ar fi ratate. În ciuda celor 6 cazuri lipsă, nu s-a pierdut sensibilitatea, dar a crescut specificitatea. Literatura de specialitate a arătat că 40-60% din cazurile de CIN2 ar fi regresat în termen de 2 ani (28, 29) și că nu toate cazurile de CIN3 erau adevărate leziuni precanceroase (30). Cook et al. au constatat, de asemenea, o rată scăzută de CIN2+ în rândul femeilor cu ARNm/ADN + (17). Prin urmare, riscul de cancer invaziv pentru cele 6 femei a fost scăzut într-un interval de timp scurt.

Am evaluat, de asemenea, performanța testului la femeile mai în vârstă și la cele mai tinere. Analiza specifică vârstei a constatat că cele trei teste au funcționat mai bine la femeile mai în vârstă de 30 de ani. Pe baza faptului că femeile mai tinere cu leziuni CIN au avut o posibilitate mai mare de regresie, sugerăm un management conservator al femeilor mai tinere. Studiile au constatat că infecția cu HPV a fost frecventă la femeile tinere, cu toate acestea, o mare parte dintre ele au fost infecții tranzitorii și pot fi eliminate spontan (31, 32). Durata scurtă a majorității infecțiilor cu HPV la aceste femei sugerează că displazia cervicală asociată ar trebui să fie gestionată conservator (12). Prin urmare, este posibil ca testul HPV ADN să nu fie o metodă de screening adecvată pentru femeile cu vârsta sub 30 de ani, din cauza ratei ridicate de fals-pozitiv. Ar trebui să se evalueze performanța de screening a citologiei și a ARNm E6/E7 în mod cuprinzător la femeile tinere. În studiul nostru, datele au arătat că citologia a avut cea mai mare specificitate la femeile sub 30 de ani, dar sensibilitatea este mai mică decât testul HPV ADN. Cu toate acestea, pentru ARNm E6/E7, a avut o performanță moderată la femeile mai tinere de 30 de ani, care a avut o sensibilitate mai mare decât citologia însoțită de o specificitate mai mare decât ADN-ul HPV, ceea ce sugerează că testarea ARNm E6/E7 poate fi o opțiune promițătoare pentru depistarea femeilor sub 30 de ani.

Deși Administrația pentru Alimente și Medicamente din China a aprobat trei vaccinuri profilactice împotriva HPV (și anume, Cervarix, Gardasil și Cecolin), prevenirea cancerului de col uterin se bazează încă pe screening. În 2009, guvernul chinez a lansat un program național de screening gratuit pentru cancerul de col uterin pentru femeile din mediul rural. În 2015, testul ADN HPV a fost utilizat pentru prima dată ca instrument de screening primar în locuri pilot. Cu toate acestea, din cauza populației numeroase, screeningul bazat pe HPV ADN ar duce inevitabil la rezultate pozitive false uriașe, ceea ce ar duce la o risipă de resurse de sănătate și la anxietate inutilă. Este promițător faptul că ARNm ar putea fi utilizat în programul național de screening al cancerului de col uterin pentru a reduce numărul de falsuri pozitive fără a pierde sensibilitatea.

În acest studiu ar trebui abordate mai multe limitări. În primul rând, acesta este un studiu transversal și nu am putut evalua riscul de progresie a leziunilor asociat cu ARNm HPV E6/E7. Cu toate acestea, am stratificat datele noastre în funcție de gradul histologic, ceea ce oferă informații cu privire la corelație. În al doilea rând, este important de menționat că rezultatele nu pot fi pe deplin generalizate la populația generală, deoarece participantele la studiu au fost recrutate din ambulatoriul din spital.

În concluzie, testul APTIMA mRNA a avut o bună concordanță cu testul Cobas 4800 HPV ADN, cu o sensibilitate similară și o specificitate mai mare pentru detectarea leziunilor cervicale de grad înalt. Este promițător faptul că ARNm ar putea fi utilizat în programul național de screening al cancerului de col uterin din China pentru a reduce numărul de falsuri pozitive fără a pierde sensibilitatea. Sunt necesare studii suplimentare pentru a evalua performanța clinică a testului mRNA la femeile mai tinere din China.

Declarație privind disponibilitatea datelor

Toate seturile de date generate pentru acest studiu sunt incluse în articol/materialul suplimentar.

Declarație etică

Studiile care au implicat participanți umani au fost revizuite și aprobate de către Rolul co-expresiei ARNm HPV E6/E7 și a proteinei p16/Ki-67 în predicția riscului de cancer de col uterin. de către Comitetul de revizuire a eticii științelor vieții al Universității Zhengzhou. Pacientele/participantele și-au dat consimțământul informat în scris pentru a participa la acest studiu.

Contribuții ale autorilor

S-KZ a contribuit la proiectare și a scris manuscrisul. ZG a contribuit la scrierea și revizuirea manuscrisului. PW, M-MJ și P-PG au contribuit la investigație și la testul ADN HPV. L-NK și Z-NW au contribuit la testul HPV mRNA. D-MZ a contribuit la examinarea citologică și histologică. QC și X-QC au efectuat analiza statistică. X-BS a contribuit la conceperea studiului și a ajutat la realizarea analizelor statistice. Y-LQ și J-GZ au contribuit la conceperea studiului și au ajutat la redactarea manuscrisului. J-GZ a ajutat la punerea în aplicare a studiului. Toți autorii au citit și aprobat manuscrisul final.

Finanțare

Această lucrare a fost susținută de Fundația Națională de Științe Naturale a Chinei (Grant nr. 81502475) și de Proiectul de știință și tehnologie al provinciei Henan (Grant nr. 172102310067).

Conflict de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Recunoștințe

Toate femeile implicate în acest studiu sunt recunoscute pentru participarea lor. De asemenea, am apreciat contribuția tuturor medicilor relevanți pentru acest studiu și ajutorul oferit de Centrul Național de Cancer, Spitalul de Cancer, Academia Chineză de Științe Medicale și Colegiul Medical Peking Union. De asemenea, am apreciat 32nd International Papillomavirus Conference (IPVC 2018) pentru că a oferit o platformă pentru a prezenta rezumatul studiului (titlu: Performanța clinică a testului HPV E6/E7 mRNA pentru detectarea neoplaziei intraepiteliale cervicale de grad înalt și a cancerului: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Abbreviații

hr-HPV, virusul papiloma uman cu risc înalt; VIA/VILI, inspecție vizuală cu acid acetic/inspecție vizuală cu soluție de iod Lugol; Papanicolau, papanicolaou; SAHZU, al doilea spital afiliat al Universității Zhengzhou; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Institutul și Spitalul de Cancer al Academiei Chineze de Științe Medicale; 95%CI, intervale confidențiale de 95%; ECC, chiuretaj endocervical; TCT, test citologic ThinPrep; CIN, neoplazie intraepitelială cervicală; LSIL, leziune intraepitelială scuamoasă de grad scăzut; HSIL, leziune intraepitelială scuamoasă de grad înalt; LBC, citologie pe bază de lichid; VPP, valoare predictivă pozitivă; NPV, valoare predictivă negativă; ASC-US, celule scuamoase atipice de semnificație nedeterminată; ASC-H, celule scuamoase atipice care nu pot exclude HSIL; AGC, celule glandulare atipice; SCC, carcinoame cu celule scuamoase; AIS, adenocarcinom in situ.

.