Evaluarea diversității microbiene a bacteriilor denitrificatoare în reactorul discontinuu

INGINERIA BIOPROCESELOR

Evaluarea diversității microbiene a bacteriilor denitrificatoare în reactorul discontinuu

S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

Comunitățile microbiene dintr-o instalație industrială de nămol activat pot contribui la procesul de denitrificare, dar informațiile privind microorganismele prezente în reactoarele de denitrificare sunt încă puține. Îndepărtarea compușilor anorganici ai azotului poate fi realizată prin adăugarea de surse de carbon la procesul biologic de denitrificare. Etanolul este o alternativă viabilă din punct de vedere economic ca sursă de carbon în țări tropicale precum Brazilia, cu o producție pe scară largă din trestie de zahăr. Această lucrare raportează aplicarea cu succes a nămolului activat cu nitrat și etanol într-un reactor anaerob discontinuu. Operațiunea a durat 61,5 h, cu un consum total de nitrați în 42,5 h, generarea de nitriți (2,0 mg/L) și consumul de etanol (830,0 mg/L) în 23,5 h. Numărul de celule denitrificatoare după numărul cel mai probabil la începutul operațiunii a fost mai mic decât la sfârșitul acesteia, confirmând capacitatea inoculului din nămol activat pentru procesul de denitrificare. Probele din numărul de celule au fost identificate ca fiind Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. și bacterii necultivate. Prin urmare, aceste specii pot fi implicate în reducerea nitraților și în consumul de etanol în reactorul discontinuu.

Cuvintele cheie: Sistem cu nămol activat; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrat; Etanol.

INTRODUCERE

Microorganismele capabile de denitrificare sunt larg răspândite în natură: sol, sedimente, apă dulce, mare și sisteme de tratare a apelor uzate (Park & Yoo, 2009).

Multe inocule din stațiile de epurare a apelor uzate menajere și industriale pot conține bacterii denitrificatoare, în principal în sistemele cu nămol activat (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), unde eliminarea biologică a azotului are loc pentru a promova denitrificarea, adică, în condiții anoxice heterotrofe, sursele de carbon organic acționează ca donatori de electroni și reduc nitratul în azot gazos (Canto et al., 2008). Prezența carbonului organic și a surselor de energie este necesară pentru denitrificarea heterotrofă (Nava et al., 2010).

Cei mai mulți dintre bacteriile denitrificatoare sunt înglobate în Phylum Proteobacteria, inclusiv Acidovorax, Comamonas și Acinetobacter, printre altele. Astfel de bacterii pot fi prezente în tratarea deșeurilor, în special în sistemele cu nămol activat, care sunt capabile să formeze azot molecular din nitrați și o sursă de carbon exogenă, cum ar fi etanolul. Denitrificarea completă, adică transformarea nitratului în azot gazos, este mediată de specii de bacterii care, în mod normal, utilizează oxigenul din aer ca sursă de energie (respirație aerobă), dar care au și capacitatea de a utiliza nitratul și nitriții în locul oxigenului (stare anoxică). Astfel, aceste bacterii se pot dezvolta aerob în absența nitraților sau în condiții anoxice în prezența nitraților. Transformarea nitratului în azot molecular este cunoscută și sub denumirea de respirație anoxică (Park & Yoo, 2009).

A fost utilizată o mare varietate de compuși organici, cum ar fi metanol, etanol, glucoză, acetat, aspartat sau acid formic și compuși aromatici (Queiroz et al., 2011). Cu toate acestea, majoritatea cercetărilor publicate cu privire la denitrificarea apei potabile implică utilizarea metanolului, a etanolului și a acidului acetic (Park & Yoo, 2009). Etanolul (Daniel et al., 2009), glucoza și acetatul sunt unii dintre donatorii externi de electroni utilizați cu succes pentru denitrificare. În special în Brazilia, etanolul reprezintă o alternativă fezabilă (Gavazza dos Santos et al., 2004). Etanolul este produs pe scară largă în Brazilia din 1975, odată cu Programul național pentru alcool (19751985). Brazilia produce aproape 2,6 x 108 tone de trestie de zahăr, care este prelucrată de 324 de fabrici de zahăr pentru a produce zahăr și etanol (Borrero et al., 2003). Acesta este produs din abundență din trestie de zahăr și, de obicei, costă mai puțin decât alte surse convenabile de carbon. Cu toate acestea, necesitatea unor surse suplimentare de donatori de electroni pentru procesul exogen crește costurile operaționale, ceea ce poate reprezenta un dezavantaj pentru utilizarea tehnologiilor inovatoare bazate pe procese anaerobe (Gavazza dos Santos et al, 2004).

Relațiile stoichiometrice care descriu reacția energetică bacteriană (Park & Yoo, 2009) se scriu după cum urmează, atunci când se utilizează etanol ca sursă de carbon:

0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O

Deși această ecuație relevă cantitatea stoichiometrică de etanol necesară pentru disimilarea nitraților, este necesar etanol suplimentar pentru dezoxigenare și sinteza celulară. În practică, 25% până la 30% din etanolul necesar este utilizat pentru sinteza celulelor bacteriene. În cazul în care este prezent oxigenul dizolvat, necesarul de etanol este în mod corespunzător mai mare. Prin urmare, o valoare de lucru comună a raportului ponderal dintre substrat și nitrat (C:N03) este de aproape 3 (Park & Yoo, 2009).

Există doar câteva referințe despre reactoarele discontinue și procesul de denitrificare. Aceste configurații pot fi utilizate pentru a investiga cerințele nutriționale (Maintinguer et al., 2008). Procesul de denitrificare cu carbohidrați complecși este evaluat în reactoare discontinue, deoarece materia organică sub formă de particule care este prezentă în aceste sisteme poate îngreuna funcționarea în alte configurații, cum ar fi cea cu amidon (Iamamoto, 2006). În plus, biomasa rămâne reținută în reactorul discontinuu în toate perioadele de funcționare, în comparație cu reactoarele cu flux continuu. Aceste fapte pot contribui la consumul total de nitrați verificat în reactorul discontinuu (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).

Eliminarea nitraților cu inocul de nămol activat a fost studiată în special în țările cu climă temperată. Există puține rapoarte de studii privind eliminarea nitraților și biologia moleculară cu inocul de nămol activat din țări tropicale precum Brazilia. În acest sens, primul obiectiv al studiului nostru a fost de a evalua procesul de denitrificare cu nămol activat ca inoculum din climatele tropicale. Al doilea obiectiv al studiului nostru a fost acela de a realiza o caracterizare microbiană a inoculului cu scopul de a identifica potențialele organisme implicate în mod specific în procesul de denitrificare.

Această lucrare a studiat diversitatea microbiană a denitrificării într-un reactor discontinuu alimentat cu etanol și nitrat folosind tehnici de biologie moleculară și metodologia tradițională de microbiologie.

MATERIALE ȘI METODE

Reactor discontinuu

Experimentul a fost realizat cu nămol provenit din sistemul de nămol activat al Stației de epurare a apelor uzate de la Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brazilia).

Reactoarele discontinue au fost pregătite în triplu exemplar în flacoane Duran® de 2 L, unde 1 L a fost mediul de reacție, 10% (v/v) inocul (100 mL/L).

Reactoarele au fost supuse unei atmosfere de N2 (99,99%) timp de 20 min după distribuirea soluțiilor. După aceea, au fost acoperite cu dopuri de cauciuc butilic, învelite și păstrate la 25 ºC ± 1 ºC, cu agitare la 120 rpm operată timp de 61,5 h.

Analiză fizico-chimică și cromatografică

Solidele volatile totale (TVS) și consumul de nitrați au fost determinate conform APHA, 2005, prin spectrofotometrie. Analiza nitriților a fost efectuată prin injecție în flux (FIA APHA, 2005). Acizii grași volatili și alcoolii au fost determinați prin cromatografie în fază gazoasă într-un aparat Shimadzu GC-2010, echipat cu detector cu ionizare de flacără, autosampler pentru headspace COMBI-PAL – AOC model 5000 și coloană HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm grosimea filmului), conform Maintinguer et al, 2008).

Cantificarea bacteriilor denitrificatoare

Numărul cel mai probabil (MPN) de bacterii denitrificatoare a fost realizat la o diluție de cinci ori mai mare la începutul și la sfârșitul funcționării reactorului discontinuu, conform Tiedje (1982), adaptat pentru probe lichide. Numărătoarea de celule prin metoda NPM a fost realizată după 15 zile de incubare, conform APHA, 2005. Compoziția mediului de cultură și, concentrațiile de nitrați și etanol utilizate în testele MPN au fost similare cu cele de funcționare a reactorului discontinuu, așa cum s-a menționat anterior.

Biologie moleculară

Eșantioanele pentru analiza ARNr 16S au fost obținute din cele mai mari numere de diluție pozitivă (MPN) de bacterii denitrificatoare la sfârșitul testului din reactoarele discontinue.

ADN-ul genomic total al probelor a fost obținut după liza celulară cu bile de sticlă (Sigma) și extracția cu fenol-cloroform, așa cum a fost descris anterior de Griffiths et al. (2000) modificat.

Amplificarea prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost realizată cu un set de amorsă de domeniu bacterian pentru gena ARNr 16S, 27 înainte (5′-AGAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) și 1100 invers (5′-AGGGTTGCGCCTGCTGTTG-3′) (Lane, 1991). Amplificarea PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) a fost efectuată cu denaturare inițială la 94 ºC timp de 5 minute, urmată de 30 de cicluri de denaturare la 94 ºC timp de 45 s, aneantizare la 55 ºC timp de 45 s, extensie la 72 ºC timp de 1,45 minute și extensie finală la 72 ºC timp de 7 minute și răcire la 4 ºC.

Eșantioanele de produse PCR (Polymerase Chain Reaction) (16S rRNA) au fost clonate în vectorul plasmidic pGEM (Promega Easy Vector System I) în conformitate cu specificațiile producătorului. Clonele au fost selectate aleatoriu și amplificate prin PCR. Secvențierea nucleotidelor a fost efectuată pe un secvențiator automat ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, SUA), în conformitate cu instrucțiunile producătorului, utilizând un primer M13 forward (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). Amplificarea PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) a fost efectuată cu denaturare inițială la 94 ºC timp de 2 minute, urmată de 25 de cicluri de denaturare la 94 ºC timp de 1 minut, aneantizare la 55 ºC timp de 1 minut, extensie la 72 ºC timp de 1 minut; și extensie finală la 72 ºC timp de 7 minute și răcire la 4 ºC.

Secvențele nucleotidice au fost procesate și au fost aliniate cu programul Seqman (pachetul Lasergene DNAstar) pentru a elimina semnalele de la vector și bazele de calitate scăzută. Secvențele aliniate au fost determinate cu ajutorul programului de căutare BLAST de pe site-ul web NCBI, comparate cu secvențele organismului cu gena ARNr 16S reprezentate în baza de date Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) și Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). Arborele filogenetic a fost construit prin metoda Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) cu ajutorul programului MEGA versiunea 4.1 (Kumar et al., 2008). Analiza de reeșantionare Bootstrap pentru 1000 de replici a fost efectuată pentru a estima încrederea topologiilor arborelui. Secvențele cunoscute de Aspergillus niger (FJ828924.1) au fost adăugate și au fost folosite ca out-group.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Nitratul a fost complet consumat după 42,5 h de funcționare (Figura 1). Generarea de nitriți a fost redusă (2,0 mg/L la 18,5 h) și a avut loc după 23,5 ore de funcționare. 1,06 g etanol/L (36% consum) a fost observat după 13,5 h de funcționare pentru o concentrație inițială de 1.650 mg/L. Consumul de etanol la sfârșitul experimentului a fost de 54% (0,77 g/L în 61,5 h). Aceste rezultate au fost apropiate de cele ale lui Gusmão et al. (2006). Autorii (op.cit.) au observat un consum de nitrați de 98,9% în 14 h de funcționare, cu celule purificate de nămol granular de la o pătură de nămol anaerob cu flux ascendent (UASB) care tratează apele reziduale de la un abator de păsări (DAKAR-Tietê SP Brazilia), cu nitrați (350 N-NO3 mg/L), etanol (377 mg/L) și benzen (10 mg/L) ca surse de carbon.

Metanolul (197,78 mg/L) și n-butanolul (23,50 mg/L) au fost detectate la începutul experimentului. Este posibil ca acești alcooli (metanol și n-butanol) să fi fost prezenți în inoculum. Concentrația alcoolilor a prezentat puține variații până la sfârșitul testului, ceea ce indică faptul că aceștia nu au fost consumați în această condiție de denitrificare (Figura 2).

Generarea maximă de acid acetic a fost de 16,7 mg/L la 61,5 h de funcționare. Valorile STV la începutul și la sfârșitul funcționării reactorului discontinuu au fost de 5,14 g/L și, respectiv, 11,40 g/L, ceea ce indică o creștere de 122% a biomasei. Aceste rezultate au arătat că condițiile de funcționare impuse reactorului discontinuu au favorizat dezvoltarea și permanența consorțiului bacterian în condiții de denitrificare.

În acest studiu a fost observat procesul de denitrificare, așa cum a fost descris și de alți autori care au folosit configurații diferite pentru reactoare.

Callado & Foresti (2001) a operat reactoare anaerobe alimentate cu substrat sintetic simulând apele uzate menajere pentru a elimina cea mai mare fracțiune de materie carbonică și pentru a promova nitrificarea substratului, denitrificarea și eliminarea biologică a fosfaților în același ciclu discontinuu, într-un reactor discontinuu secvențial anaerob/aerob/anaerob. Sistemul a funcționat timp de 41 de zile, cu 84 de cicluri de 12 ore, la o temperatură de 28±1 ºC. Autorii (op.cit,) au observat că denitrificarea a avut loc în condiții alternative aerobe și anoxice în faza de reacție. Ambele procese au avut loc numai atunci când s-a adăugat acetat de sodiu (500 mg/L) la începutul fazei anoxice.

Etchebehere et al. (2001), au testat acetat (40 mmol/L) și glucoză (13 mmol/L) ca surse de carbon pentru denitrificare într-un reactor anaerob discontinuu cu nitrat de potasiu (20 mmol/L) pentru trei inoculi diferiți: nămol provenit dintr-un reactor anoxic (la scară de laborator) pentru a elimina carbonul și azotul din levigatul unui depozit de deșeuri sanitare; nămol provenit dintr-un reactor metanogen UASB care tratează malțul și nămol provenit dintr-un reactor anoxic alimentat cu acetat și nitrat. Nitratul a fost complet consumat din cele trei probe de nămol testate, așa cum s-a observat în prezentul studiu. Autorii (op. cit.) au concluzionat că acetatul este o sursă de carbon mai bună decât glucoza.

Gavazza dos Santos et al. (2004) au studiat procesul de denitrificare realizat în reactoare discontinue alimentate cu ape reziduale sintetice care simulează efluenții nitrificați din stațiile de epurare a apelor uzate menajere, folosind trei surse donatoare de electroni: metanol (53,3 mg/L), etanol (38,3 mg/L) și metan (în afară de apele reziduale sintetice). Autorii (op.cit.) au observat că cel mai eficient donor de electroni a fost etanolul, care a eliminat complet nitriții și nitrații, așa cum s-a observat în această lucrare.

Iamamoto (2006) a obținut o eliminare a azotului mai mare de 84% într-un reactor discontinuu secvențial alimentat cu amidon și amoniu alternând condiții anoxice și aerobe (cicluri 2h/2h) și 2 mg O2/L pentru următoarele concentrații: 125 mg N-NH4/L și 0,95 g de amidon/L, 250 mg N-NH4/L și 1,9 g de amidon/L, 500 mg N-NH4/L și 3,9 g de amidon/L.8 g amidon/L, cu inocul dintr-un sistem de nămol activat al unei stații de epurare a apelor uzate (Flores da Cunha Rio Claro SP Brazilia). Etanolul (1.500 mg/L) a fost, de asemenea, testat ca sursă de carbon împreună cu 500 mg NH4-N/L. Autorii (op.cit.) au observat că eliminarea nitriților și nitraților a fost completă (100%), așa cum s-a observat și în studiul de față, demonstrând fezabilitatea utilizării etanolului în procesul de denitrificare.

Conturile de celule denitrificatoare prin MPN la începutul funcționării reactorului discontinuu au fost mai mici (1,1 x 1010 MPN/mL) decât la sfârșitul funcționării (1,2 x 1019 MPN/mL) (Figura 3) (Figura 3). Aceste rezultate sunt mai mari decât cele raportate în literatura de specialitate, descrise mai jos.

Etchebehere et al. (2001) au numărat celulele denitrificatoare după numărul cel mai probabil (MPN) într-un mediu bazal suplimentat cu extract de drojdie (0,5 g/L), acetat de potasiu (1,84 g/ L) și nitrat de potasiu (0,72 g/ L) și au obținut 9,6 x 106 MPN/mL cu nămol din reactorul anoxic al unui sistem de tratare a levigatului. Callado și Foresti (2001) au utilizat acetat de sodiu ca sursă de carbon într-un reactor secvențial anaerob/ aerob/anaerob discontinuu și au găsit mai multe bacterii denitrificatoare MPN la începutul operațiunii (2,5 x 106 MPN/mL) decât la sfârșitul acesteia (3,5 x 105 MPN/mL). Autorii (op.cit.) au concluzionat că această scădere nu a afectat procesul de denitrificare.

Iamamoto (2006) a obținut același ordin de mărime în ceea ce privește MPN-ul bacteriilor denitrificatoare la sfârșitul funcționării unui reactor discontinuu secvențial cu 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) și 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), ambele cu adaos de amidon (1.900 mg/L) ca sursă de carbon și inocul din nămol activat de la o stație de epurare a apelor uzate (Rio Claro SP – Brazilia).

Bacteriile denitrificatoare au fost favorizate de condiția nutrițională impusă în reactorul anoxic. Acest fapt a confirmat capacitatea inoculului din nămol activat pentru procesul de denitrificare.

Cincizeci de clone au fost obținute din proba analizată pentru clonarea și secvențierea fragmentelor din gena 16S ARNr a consorțiului microbian. Cu toate acestea, clonele cu valori mai mici de 180 nucleotide nu au fost încorporate în analiza filogenetică deoarece nu au fost suficiente pentru a fi comparate cu baza de date descrisă mai jos. Secvențele rezultate din clonare și secvențiere au fost obținute din proba pozitivă cu cea mai mare diluție MPN (10-18) (tabelul 1).

Acinetobacter sp. a fost identificat cu similitudinile de: 98% (clonele 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 și 2, 4, 18, 20, 23 și 27) și 99% (clonele 6, 15, 16, 37 și 38). Este o bacterie Gram-negativă, nemobilă, oxidaza-negativă, nefermentativă, în perechi și aparține filumului Proteobacteria, familia Moraxellaceae. Este un microorganism important în sol, unde poate contribui la mineralizarea, de exemplu, a compușilor aromatici (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) au izolat tulpini de Acinetobacter într-o probă dintr-un sistem de nămol activat (Jizhuangzi Tianjin – China). Această tulpină a fost capabilă să biodegradeze fenolul (1,1 g/L) prin celule libere și imobilizate. Geng et al. (2006) au izolat bacterii care degradează fenolul într-o probă dintr-un sistem de tratare cu nămol activat (Singapore). Testele biochimice au arătat că aceste microorganisme se pot dezvolta în prezența etanolului, glucozei, zaharozei și a compușilor aromatici precum toluenul, fenolul și benzoatul. A fost descrisă ca o nouă specie, Acinetobacter EDP3. Autorii (op.cit.) au concluzionat că această specie poate fi utilizată pentru eliminarea compușilor fenolici sau pentru bioremedierea in situ a fenolului din soluri. Cai et al. (2009) au identificat 58 de bacterii rezistente din soluri contaminate cu arsenic. Tulpinile Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas și Stenotrophomonas au fost identificate în concentrații ridicate (20 mM Ar/L). Acinetobacter sp. identificate în această lucrare au avut creșterea lor datorită condițiilor operaționale impuse și ar putea contribui la denitrificare.

Clonele 24 și 26 au fost similare cu Comamonas sp. cu similitudini de 98% și, respectiv, 97%. Comamonas sunt bacterii Gram-negative aparținând Phylum Proteobacteria, familia Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) au izolat bacterii denitrificatoare Gram-negative dintr-un reactor anoxic utilizat pentru tratarea levigatului din depozitele de deșeuri din Montevideo (Uruguay). Speciile izolate prezentau similitudini cu Comamonas terrigena. Cu toate acestea, acest microorganism a fost considerat o nouă specie, denumită Comamonas nitrativorans. A fost descrisă ca fiind o bacterie gram-negativă, cu flagel polar mobil, aerobă și chimioorganotrofă. Această specie a crescut în etanol, acetat și butirat, nitrat, nitrit și poate reduce nitratul la N2.

Prin urmare, speciile Comamonas identificate în acest studiu au fost prezente în inoculul de nămol activat și ar putea contribui la denitrificarea care a avut loc în cadrul testelor.

Clonele 25, 28, 34, 34, 36, 42 și 65 au fost similare cu Acidovorax sp. cu similarități de 99% și, respectiv, 97% (tabelul 1). Acidovorax sp. aparține filumului Proteobacteria; este ușor de găsit în sistemele de nămol activat. O mulțime de specii de Acidovorax acționează ca microorganisme de reglare a proceselor de tratare microbiologică în sistemele cu nămol activat. Mai multe specii de Acidovorax sunt utilizate în biodegradarea plasticului și în eliminarea altor contaminanți organici, inclusiv a nitrofenolilor, nitrobenzenului și bifenililor policlorurați prin denitrificare (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) au izolat specii de bacterii denitrificatoare care degradează PHBV (poli-3-hidroxibutirat-co-3-hidroxivalerat) din trei sisteme de nămol activat, utilizate pentru tratarea apelor uzate municipale (Nagoya, Osaka și Toyohashi – Japonia). Cele 37 de clone analizate au prezentat similitudini cu organisme aparținând clasei Betaproteobacteria. Cele mai multe clone au prezentat similaritate cu specia Acidovorax, confirmând că această specie a fost implicată în degradarea PHBV în condiții de denitrificare. Gentile et al. (2007) au izolat specii similare cu Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium și Achromobacter dintr-un reactor de denitrificare care a funcționat cu etanol (40,0 g/L) și acid lactic (40,0 g/L) ca surse de carbon; au testat separat donatorii de electroni, iar ca sursă de azot au folosit nitrat (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L). Autorii (op. cit.) au concluzionat că reducerea completă a nitraților la N2 a fost realizată de speciile Acidovorax, în timp ce Achromobacter sp. și Delftia acidovorans au fost responsabile de denitrificarea incompletă a nitraților la nitriți. Prin urmare, speciile Acidovorax au fost prezente în probele analizate în acest studiu și ar putea fi implicate în denitrificarea care a avut loc în reactorul discontinuu.

S-au identificat tulpini bacteriene necultivate din familia Rhodocyclaceae cu o similaritate de 98% (clona 9 – AY945917.1 și clonele 46, 84 AY945905), așa cum se arată în tabelul 1. Membrii familiei Rhodocyclaceae sunt bacterii Gram-negative aparținând clasei Betaproteobacteria. Sunt tije aerobe denitrificatoare cu capacitate metabolică versatilă. Majoritatea speciilor trăiesc în habitate acvatice și în condiții de sol oligotrofic. Multe dintre ele sunt prezente în apele reziduale și joacă un rol important în tratamentul biologic de decontaminare a acestor situri (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006), au alimentat un reactor de denitrificare cu chinolină (40 mg/L), o amină toxică utilizată la fabricarea coloranților, pesticidelor și combustibililor sintetici, glucoză (180 mg/L), nitrat și fosfat de potasiu (C/N/P de 150:30:1). Inoculul a provenit din cel de-al doilea bazin de sedimentare al sistemului de tratare a apelor uzate de la Industry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japonia). Eliminarea chinolinei a fost de 90,2% după perioada de reactor în regim de echilibru (6 săptămâni). Analizele biologice moleculare ale inoculului și din reactorul de denitrificare au evidențiat bacterii necultivate, Thauera și Azoarcus în ambele teste. Potrivit autorilor, procentele de clone afiliate cu bacterii aparținând Azoarcus și Thauera au fost de 74% în reactorul de denitrificare și, respectiv, de 4% în inoculum. Cunoașterea microorganismelor din probele de mediu este dependentă de condițiile de laborator cu culturi pure (Pace, 1997). Cu toate acestea, mai puțin de 1% din bacteriile din diferite ecosisteme sunt cunoscute (Amann, 1995), sau aproximativ 99% nu au fost studiate și identificate. Prin urmare, în această lucrare ne-am așteptat să obținem secvențe similare de bacterii necultivate.

Arborele filogenetic obținut cu primeri consensuali din domeniul Bacteria în analizele de biologie moleculară ale experimentului este ilustrat la Figura 4.

Ceficienții de similaritate între diferitele grupuri de microorganisme au fost de 97% până la 99% și au indicat prezența unor specii înrudite filogenetic, pe baza secvențelor parțiale de evaluare a genei 16S ARNr. Secvențele cunoscute ale speciilor proveneau din baza de date NCBI, cu Aspergillus niger (FJ828924.1) ca secvență din afara grupului de.

În consecință, speciile Acidovorax, Comamonas și Acinetobacter identificate în acest studiu au fost prezente în sistemul de nămol activat de la Volkswagen São Carlos Motors și ar putea fi implicate în reducerea nitraților și în consumul de etanol.

CONCLUZII

Potențialul inoculului provenit dintr-un sistem de nămol activat și utilizarea etanolului ca sursă de carbon într-un proces de denitrificare au fost demonstrate într-un reactor discontinuu.

Valorile MPN ale bacteriilor denitrificatoare obținute în acest studiu, combinate cu rezultatele privind eliminarea nitraților, au arătat că în inoculul provenit dintr-un sistem de nămol activat au existat bacterii denitrificatoare, care au fost favorizate de condițiile nutriționale impuse.

Clonii identificați au avut afiliere filogenetică în phylum Proteobacteria, clasa Alphaproteobacteria și Gamaproteobacteria, cu Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. și bacterii necultivate. Aceste bacterii ar putea fi implicate în reducerea nitraților și în consumul de etanol în reactorul anoxic discontinuu.

CONȘTIINȚE DE RECUNOAȘTERE

Autorii recunosc cu recunoștință granturile primite de la FAPESP și CNPq.

APHA, AWWA și WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. Ediția a 22-a, American Public Health Association, Washington, DC (2005).

Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. Teză de doctorat, Universitatea din São Paulo, Brazilia, Școala de Inginerie, Universitatea din São Carlos, Brazilia (2006).

Messing, J., New M13 vectors for cloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).

Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).