Efecte diferențiale asupra permeabilității membranare și viabilității celulelor keratinocitare umane supuse unor câmpuri megasonice de intensitate foarte mică

Efectul expunerii la US de intensitate foarte mică (Ispta între 7 și 16 mW/cm2, mult sub pragul de cavitație, 100 mW/cm2) cu o frecvență de 1 MHz a fost studiat asupra celulelor HaCaT. Experimentele au fost efectuate cu o configurație medicală echivalentă schițată în figura S1 din ESI, la parametri de tratament variați, cum ar fi Ispta, ciclul de funcționare și timpul de sonicare. Experimentele preliminare au evidențiat faptul că, în intervalul de parametri de expunere implicat aici, temperatura a rămas constantă (în limita a 1 °C), excluzând disiparea termică a energiei US. În plus, tratamentele nu au evidențiat nicio dependență semnificativă a efectelor studiate de ciclul de lucru al undelor US. Aceste observații sunt în concordanță cu absorbția scăzută a US la 1 MHz; dimpotrivă, efectele termice și ciclul de funcționare ar putea afecta celulele și țesuturile expuse la frecvențe mai mari, coeficientul de atenuare US fiind proporțional cu frecvența23,31.

Rezultatele vor fi prezentate inițial luând în considerare separat cei doi parametri de expunere relevanți, timpul de sonicare și Ispta. Modificările structurale și fizice ale membranei celulare (permeabilitatea, eficiența absorbției și dimensiunea maximă a moleculelor internalizate) vor fi analizate și corelate cu leziunile citotoxice corespunzătoare și cu posibila activare a tiparelor inflamatorii. Ulterior, rezultatele vor fi interpretate în termeni de doză de sonicare, definită ca produsul dintre Ispta și timpul de expunere, și anume densitatea de suprafață a energiei acustice incidente asupra probei în timpul sonicării. De fapt, fenomenele studiate depind de această mărime și acest lucru ne-a permis să identificăm o gamă de parametri de expunere în care apare un SP tranzitoriu cu daune biologice neglijabile.

Analiza influenței timpului de expunere la US

Alterările în permeabilitatea membranară a celulelor HaCaT induse de US de intensitate mică de 1 MHz au fost estimate în termeni de eficiență de absorbție a sondei fluorescente verzi calceină. Deoarece membranele intacte sunt impermeabile la calceină, aceasta reprezintă un marker fiabil pentru SP. Procentul de celule pozitive la culoarea verde a fost cuantificat prin analize prin citometrie în flux, în conformitate cu secțiunea 2.5.

Pentru a evalua sensibilitatea permeabilității membranei la timpul de expunere la US, s-a utilizat un US Ispta foarte scăzut. În mod notabil, deja o Ispta de 7 ± 1 mW/cm2 pot fi declanșate efecte semnificative asupra permeabilității membranare prin timpi de expunere corespunzători. Rezultatele reprezentative ale unei investigații paralele de citometrie în flux pe celule HaCaT și NIH-3T3, ambele sonicate la Ispta ~7 mW/cm2 timp de 5′, 15′, 30′ și 45′, sunt prezentate în Fig. 1 (triunghiuri roșii și, respectiv, pătrate albastre). Așa cum era de așteptat, comparația dintre liniile celulare după timpi de sonicare mici (sub pragul de sonoporare) are ca rezultat o afinitate mică a calceinei, în cazul în care diferențele (cele mai mari în cazul celulelor HaCaT) ar trebui să explice caracteristicile de compoziție și permeabilitate ale membranelor lor respective. Mai important, ambele linii celulare prezintă o creștere semnificativă a eficienței de absorbție începând cu 15′ de expunere, ceea ce corespunde unei doze de sonicare de (6,3 ± 0,9) J/cm2, sugerând activarea procesului de SP. Conform celor mai bune ajustări din Fig. 1, pentru timpi de expunere mai lungi, experimentele noastre evidențiază o corelație liniară între eficiența absorbției și timpul de expunere, cu o rată de absorbție identică indusă de US atât în celulele HaCaT, cât și în celulele NIH-3T3 (pante de regresie liniară (%/min) 1,3 ± 0,2 și 1,4 ± 0,2, pentru HaCaT și NIH-3T3, respectiv). Acest lucru ar însemna că creșterea eficienței de absorbție datorată SP este un fenomen independent de linia celulară.

Pentru a investiga în continuare procesul de SP și a caracteriza internalizarea, celulele HaCaT tratate au fost evaluate prin microscopie cu fluorescență. În concordanță cu rezultatele citometriei de flux, probele sonicate timp de 5′ nu prezintă nicio modificare semnificativă a permeabilității membranare în raport cu proba de control (netratată), în timp ce începând cu 15′ se observă o creștere a eficienței de absorbție (așa cum se arată în Fig. 2 și Figura S2 din ESI), deși nu toate celulele au prezentat fluorescență. În mod corespunzător, celulele par mai puțin dense și aderente în comparație cu proba de control, sugerând o slăbire a joncțiunilor strânse. Imaginile reprezentative din Fig. 2 sugerează o localizare eterogenă a calceinei în interiorul celulelor și, de fapt, microscopia confocală cu fluorescență a permis să se distingă clar în celulele HaCaT distribuția periferică a sondei de cea internă (a se vedea imaginea și reconstrucțiile 3D din Fig. 3). Alte imagini detaliate sunt prezentate în secțiunea 3 din ESI. Observațiile sunt în concordanță cu o absorbție pe două niveluri a sondei fluorurate: unul periferic, în care sonda este localizată în rețeaua reticulului endoplasmatic din jurul membranei plasmatice; celălalt, prezentat în mod semnificativ după expunerea la 30′, în care difuzia sondei în citoplasmă determină o fluorescență intensă distribuită uniform în întreaga celulă, inclusiv în nucleoplasmă. Trebuie remarcat faptul că diametrul Stokes al calceinei este de ~1,36 nm, iar transportul său intranuclear nu este împiedicat de bariere difuzive29. O analiză mai completă raportată în secțiunile 3.2 și 3.3 permite să se concluzioneze că doza de US de expunere și greutatea moleculară a sondei au fost factori dominanți în determinarea absorbției.

Un alt test bazat pe fluoroscopul roșu PI a fost efectuat pentru a evalua recuperarea permeabilității membranei native a celulelor sonicate (a se vedea, de asemenea, secțiunea 2.3). Internalizarea PI denotă activarea proceselor citotoxice. Co-localizarea coloranților verzi și roșii în interiorul celulelor indică, prin urmare, eșecul procesului de recuperare a membranei după SP. Pe de altă parte, observarea în celule a fluorescenței verzi în absența celei roșii indică apariția SP membranare în timpul tratamentului cu US și recuperarea cu succes a acesteia după oprirea câmpului. Imagini confocale de fluorescență reprezentative sunt prezentate în Fig. 4. Colocalizarea celor doi coloranți este absentă în celulele tratate timp de 15′, în timp ce aceasta este abia observată după 30′ de expunere (Figura S5 din ESI). În mod consecvent, s-a evidențiat o pierdere netă de viabilitate de ~5%, după cum s-a verificat prin citometrie în flux. În cazul celulelor sonicate timp de 45′, ceea ce corespunde unei doze de (19 ± 3) J/cm2, colocalizarea pare mai evidentă (a se vedea săgețile albe din Fig. 4B) și are loc o pierdere mai semnificativă a viabilității (~10%, după cum s-a verificat prin citometrie de flux). Aceste constatări sugerează că un timp de expunere mai lung, corespunzător unei doze mai mari la Ispta fixă, induce o alterare ireversibilă a structurii membranare urmată de un răspuns citotoxic consecvent.

Analiza influenței intensității US

Efectul variației intensității câmpului US aplicat asupra permeabilității membranare a fost analizat pe linia celulară HaCaT după 15′ de expunere, suficient de scurtă pentru a exclude efectele induse de o sonicare de lungă durată. În studiul nostru, intensitățile US au fost cuprinse între Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 și Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, cu mult sub pragul de cavitație24. În conformitate cu protocolul descris în secțiunile 2.3 și 2.5, au fost utilizate dextrane marcate cu FITC de diferite MW (MW = 10, 40 și 70 kDa) pentru a caracteriza, pentru fiecare intensitate US, inducerea permeabilității membranare la diferite dimensiuni ale moleculelor. Această procedură permite, la rândul său, să se evalueze dimensiunea sonoporului. În mod similar calceinei, dextranii nu pătrund în mod semnificativ în celulele netratate31,32, în timp ce, în regimul de US prin cavitație, absorbția celulară a dextranilor marcați cu FITC poate fi puternic crescută atât prin SP, cât și prin promovarea traficului de endosome30. În acest sens, rezultatele măsurătorilor prin citometrie în flux raportate în Fig. 5 arată clar o absorbție dependentă de dimensiune, fenomen care ne permite să excludem concomitența efectelor de endocitoză activă și, conform literaturii de specialitate22, sugerează SP declanșată la intensitate scăzută ca principal mecanism implicat în transportul moleculelor de dextran prin membrana plasmatică. În mod specific, absorbția indusă de SP observată este caracterizată de un prag Ispta, care crește liniar odată cu creșterea MW a moleculelor internalizate. Sub acest prag, eficiența de absorbție a celulelor tratate este comparabilă cu cea a celulelor neexpuse. Valorile pragului Ispta sunt prezentate în tabelul 1. Pentru intensități superioare pragului, eficiența absorbției crește odată cu creșterea Ispta până când se atinge un maxim. Pentru dextranul de 10 kDa, apoi scade ușor până la un platou. Scăderea observată a eficienței de absorbție la intensități ridicate poate fi explicată prin creșterea numărului de celule moarte, care sunt eliminate din probă la clătire, neavând astfel nicio contribuție la analizele de citometrie în flux. În plus, activarea proceselor apoptotice ar putea împiedica internalizarea colorantului. În mod notabil, pentru Ispta = 15 mW/cm2, deși această valoare este mult mai mică decât pragul de cavitație, celulele sunt capabile să internalizeze dextrani de 70 kDa, cu un diametru Stokes de ~12 nm. Această valoare poate fi luată ca o estimare a dimensiunii minime a sonoporilor produși în membrană. În figura S6 (secțiunea 4 din ESI) este raportat un set de imagini de fluorescență reprezentative care prezintă absorbția de dextrans la pragul Ispta împreună cu testul PI.

Internalizarea PI evidențiază un răspuns citotoxic semnificativ la Ispta = 15 mW/cm2 (doza de expunere 13,5 J/cm2). Așa cum au raportat Udroiu et al.13 în condiții experimentale similare, s-a observat, de asemenea, o creștere ușoară, dar semnificativă a incidenței micronuclei în celulele NIH-3T3, în funcție de intensitatea și timpul de expunere la 1 MHz US. Aceste observații au sugerat că sunt necesare studii suplimentare pentru a înțelege mai bine bioefectele care însoțesc SP de membrană și, prin urmare, a fost efectuat un studiu al răspunsului biologic al celulelor sonicate în funcție de intensitatea US.

Răspunsul biologic la „rănile de membrană” induse de SP prin intensități US foarte mici a fost caracterizat în detaliu prin evaluarea morții celulare, utilizând testul combinat AnnexinV și PI descris în secțiunea 2.5 (a se vedea, de asemenea, secțiunea 5 din ESI). Am evaluat, de asemenea, expresia genei IL-6, o citokină care face legătura între inflamația cronică și cancer33,34. Rezultatele analizei prin citometrie în flux, exprimate în termeni de procent de celule, sunt raportate în Fig. 6. Viabilitatea celulară este în mare parte păstrată (>90%) în timpul tratamentelor de 15′, cu toate acestea, începând cu Ispta = 9 mW/cm2 se produce o ușoară scădere, însoțită de o creștere a celulelor apoptotice timpurii. La Ispta = 14 mW/cm2 începe să se observe un procent semnificativ de celule necrotice, în timp ce la Ispta = 16 mW/cm2 și apoptoza târzie contribuie la moartea celulară, în corespondență cu o ușoară reducere a necrozei (diagramele reprezentative ale punctelor de citometrie în flux în Figura S7 din ESI). Expresia genei IL-6 a fost determinată prin RT-PCR (Fig. 7). Nu s-a observat nicio suprareglare pentru Ispta ≤15 mW/cm2, în timp ce tratamentul la 16 mW/cm2 a indus o supraexprimare a acestei gene în comparație cu cea a celulelor netratate.

Aceste constatări sugerează că, pornind de la un prag Ispta de 16 mW/cm2 și 15′ de sonicare, deteriorarea membranară cauzată de US nu numai că scade viabilitatea celulară, dar, prin supraexprimarea genei IL-6 legată de inflamație, ar putea induce un răspuns inflamator. Având în vedere că mai multe cercetări au recunoscut un rol al inflamației în promovarea patogenezei și progresia unor boli precum cancerul35,36, sunt necesare investigații suplimentare pentru a caracteriza mai bine aspectele legate de modelele inflamatorii.

Analiză a influenței dozei de sonicare

Pentru a analiza cantitativ relația dintre câmpul US aplicat și efectele biologice observate în ceea ce privește energia livrată celulelor în timpul expunerii, doza de sonicare a fost calculată pentru fiecare tratament ca produs al intensității Ispta cu timpul de expunere. Valorile obținute sunt raportate în tabelul 2, în care efectele biologice observate sunt identificate prin culori de fond. Rezultatele noastre sugerează că SP membranar apare începând cu o doză de prag de aproximativ 6,3 J/cm2. Mai mult, dimensiunea sonoporilor poate fi legată de doza de sonicare. Pentru doze mai mari de 10,8 J/cm2 se observă o scădere a viabilității și evenimente concomitente de apoptoză timpurie în celula tratată, urmate, începând cu 14,4 J/cm2, de apoptoză târzie, necroză și supraexprimarea IL-6.

Subliniem faptul că această doză, și Ispta 16 mW/cm2, corespunde unei presiuni de vârf negative de ~0,02 MPa. Această valoare pare suficient de ridicată pentru a induce o tensiune mecanică la interfața membrană plasmatică/apă, deși este cu un ordin de mărime mai mică decât valoarea pragului de siguranță a expunerii sugerată până în prezent (indice mecanic ~0,2-0,3, la 1 MHz).

Rețineți că experimentele noastre au fost comparate cu succes cu cele realizate prin utilizarea unui sistem electromedical utilizat efectiv în terapia cu ultrasunete (a se vedea, de asemenea, secțiunea 2.2), subliniind astfel relevanța medicală a abordării noastre. În acest sens, suntem încrezători că furnizarea de informații privind doza de sonicare (la frecvența fixă de US) permite un indice mai complet de caracterizare a răspunsului celular la expunerea la US și, la rândul său, o identificare fină a unei serii de parametri în care apare SP tranzitoriu cu daune biologice neglijabile.

Un pas foarte important pentru înțelegerea impactului biologic in vivo al rezultatelor noastre ar fi operarea expunerilor US pe biosisteme tridimensionale, cum ar fi țesuturile umane compuse din cheratinocite multistrat sau din celule endoteliale din bariera hematoencefalică.

.