Depistarea imunoenzimatică a difenhidraminei (Benadryl®) în urină și sânge Using a Newly Developed Assay

Efectele de inducere a somnului ale DPH au dus la combinarea acestuia cu alte medicamente, cum ar fi paracetamolul, în formulări ca Tylenol PM™, sau cu decongestionante nazale ca pseudoefedrina. Chiar dacă DPH este unul dintre cele mai vechi antihistaminice, este ușor disponibil fără prescripție medicală și este mai eficient și cu acțiune rapidă decât unele dintre cele mai recente medicamente eliberate pe bază de rețetă, de unde și utilizarea sa pe scară largă (6). Eticheta de avertizare de pe Benadryl indică în mod clar pericolul de a conduce după administrarea medicamentului. Mai mult, numeroase studii au dovedit în mod clar afectarea abilităților motorii și a performanțelor cognitive asociate cu sarcina complexă de a conduce automobile după administrarea de DPH în comparație cu un antihistaminic de a doua generație sau chiar cu alcoolul (7-12). A existat, de asemenea, un studiu privind riscul crescut de rănire după administrarea de DPH în comparație cu antihistaminicele de a doua generație (13). Aceste studii ar raționaliza în mod clar importanța testării în primul rând pentru DPH.

DPH este disponibil în mai multe forme de dozare, inclusiv lichid, tablete, capsule, gume de mestecat și creme topice. Dozajul sugerat pentru adulți este în intervalul de 25-50 mg la fiecare 4-6 h, fără a depăși 50-100 mg (1). Atunci când se administrează DPH, acesta este absorbit rapid de organism, activitatea maximă fiind observată la aproximativ 1 h după administrarea medicamentului. Timpul de înjumătățire al DPH este de aproximativ 2-9 h, concentrațiile plasmatice maxime fiind atinse după aproximativ 1-4 h de la administrarea dozei. În urma administrării unei doze orale unice de 50 mg, după 3 h au fost detectate concentrații plasmatice maxime medii de 83 ng/mL de difenhidramină, care au scăzut apoi la 9 ng/mL până la 24 h (14). O singură doză orală de 100 mg de DPH a dus la concentrații plasmatice medii de vârf de 112 ng/mL la 2 h după administrare (15). Eficacitatea antihistaminicelor este observată la concentrații mai mari de 25 ng/mL, somnolența poate fi observată la 30-40 ng/mL, iar afectarea mentală se observă la concentrații de peste 60 ng/mL (16). S-a raportat că nivelurile terapeutice de DPH în sânge variază între 25 și 112 ng/mL, nivelurile toxice sunt de aproximativ 5 000 ng/mL, iar nivelurile letale depășesc oriunde 8 000 ng/mL (3, 17). Au existat, de asemenea, mai multe cazuri de abuz de DPH care au fost documentate de-a lungul mai multor ani (18-20).

Metabolizarea in vivo a DPH are ca rezultat faptul că aproximativ 30% din doză este transformată în metabolitul N-desmetil, urmată de formarea metabolitului N,N-didesmetil și 13% din doză este transformată în metaboliți acetil prin intermediul aminei. Un procent mic este transformat în acid difenilmetoxiacetic, iar procentul majoritar rămas din doză este excretat neschimbat ca medicament mamă (21, 22). Metabolismul difenhidraminei este prezentat în figura 2.

Metodele tradiționale de testare a DPH în plasma umană au implicat extracția de probe costisitoare și consumatoare de timp, urmată de proceduri de confirmare. Mai multe grupuri au raportat utilizarea diferitelor metode gaz-cromatografice (GC) pentru detectarea DPH în plasmă și urină (23-27). Au existat, de asemenea, rapoarte privind metodele de electroforeză capilară (28) și de cromatografie lichidă-spectrometrică de masă (LC-MS) (29) care au fost dezvoltate pentru detectarea DPH. Până în prezent, în literatura de specialitate nu au existat rapoarte privind depistarea difenhidraminei prin ELISA sau orice altă metodă de imunodozare. În această publicație, raportăm prima metodă de screening ELISA pentru DPH în urina și sângele uman.

Este considerată o practică standard în laboratoarele de toxicologie de a efectua un screening prin imunodozare, în care probele pozitive sunt mai întâi identificate și confirmate ulterior prin tehnici GC-MS sau LC-MS. Acest lucru este utilizat ca o strategie „cost-beneficiu” de către majoritatea laboratoarelor de toxicologie, spre deosebire de efectuarea unei proceduri de confirmare mai costisitoare pentru fiecare probă primită. Prin urmare, ar fi utilă o metodă de depistare ELISA fiabilă care să poată fi aplicată la eșantioanele DPH legate de accidentele și decesele cauzate de accidente rutiere. În acest scop, toxicologii au formulat recomandări pentru DUID, inclusiv o valoare limită propusă pentru DPH de 25 ng/mL în sânge și de 50 ng/mL în urină (30). Această lucrare descrie o metodă de screening ELISA robustă și precisă pentru DPH în urină și sânge uman, în conformitate cu aceste orientări propuse.

Experimental

Materiale

Reactivi și substanțe chimice. Difenhidramina a fost obținută de la Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), iar difenhidramină-d3 (100 μg/mL soluție în metanol) a fost obținută de la Cerilliant (Round Rock, TX). Anticorpul policlonal specific DPH a fost crescut de Immunalysis (Pomona, CA), iar haptenii DPH și conjugatele marcate cu peroxidază de hrean au fost sintetizate la Immunalysis. Reactivul substrat 3,3′,5,5,5′-tetrametilbenzidină (TMB) utilizat pentru reacția colorimetrică a fost obținut de la Pierce (Rockford, IL). Enzimele utilizate în acest proces au fost tiroglobulina bovină (BTG) obținută de la Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), peroxidaza de hrean (HRP) obținută de la BBI Enzymes (Madison, WI) și seroalbumina bovină (BSA) obținută de la Proliant Biologicals (Boone, IA). Toți solvenții utilizați au fost de calitate HPLC, iar toate substanțele chimice au fost de calitate ACS și au fost obținute de la Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Pentru ELISA, calibratorii de nivel înalt pentru DPH la 1000 ng/mL au fost preparați în urină sintetică negativă și sânge sintetic negativ și depozitați la 4°C. Urina negativă sintetică și sângele negativ sintetic utilizate în acest test au fost formulate cu ingrediente care se găsesc în matricile respective și au corespuns răspunsurilor imunoenzimatice a trei probe negative de urină și sânge uman (31, 32). Urina negativă sintetică constă într-o soluție de 0,1% BSA în apă deionizată; cu 0,2% FD&C colorant galben #6, iar sângele negativ sintetic constă într-o formulă brevetată de Immunalysis.

Aparat. Coloanele de afinitate HiTrap protein G HP care au fost utilizate pentru purificarea imunoglobulinei G (IgG) au fost achiziționate de la GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Plăcile standard de microtitrare din polistiren (96 de godeuri) au fost obținute de la Corning Costar (Corning, NY). Un dispozitiv de spălare a plăcilor de microtitrare Tecan Columbus Pro și un cititor de plăci Tecan Sunrise au fost obținute de la Tecan (San Jose, CA). Pipele care au fost utilizate în timpul procesului de dezvoltare a imunoanalizei au fost toate obținute de la Rainin Instruments (Oakland, CA). Un MS 6410 triplu-cadrupol 6410 și coloana Zorbax Eclipse XDB C18 utilizată pentru analiza LC-MS-MS au fost ambele achiziționate de la Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Methods

ELISA. Etapa principală în dezvoltarea metodei ELISA a implicat generarea de anticorpi policlonali care s-au bazat pe răspunsul imunochimic al unei specii de animale selectate la un antigen specific DPH. În acest scop, iepurii au fost imunizați mai întâi cu un antigen DPH constând în DPH conjugat cu tiroglobulina bovină (BTG). Procesul de imunizare și de sângerare a iepurilor a fost încredințat unei unități specializate în animale. Serul obținut de la iepuri a fost purificat intern prin cromatografie de afinitate prin eluție prin coloane de proteină G, pentru a obține fracțiunea IgG purificată. IgG policlonală specifică DPH a fost apoi imobilizată pe plăci de microtitrare din polistiren cu 96 de godeuri. Excesul de anticorp a fost aspirat, situsurile de legare a anticorpilor liberi au fost blocate cu o soluție de trehaloză 1% în apă, iar plăcile au fost apoi uscate într-un cuptor în vid la 37°C peste noapte. Plăcile au fost depozitate în continuare într-o pungă sigilată cu desicant, deoarece este esențial ca acestea să fie lipsite de umiditate. O curbă doză-răspuns a DPH în urină a fost mai întâi pregătită prin fortificarea urinei sintetice negative la 1, 2, 5, 10, 25, 25, 50, 50, 100, 250 și 500 ng/mL din soluția stoc de calibrare ridicată a medicamentului. Curba de sânge a fost obținută prin fortificarea sângelui sintetic negativ la 1, 5, 10, 25, 50, 100 și 250 ng/mL din soluția de calibrare ridicată. Acești calibratori din sângele sintetic au fost apoi diluați suplimentar 1:10 cu 100 mM de tampon fosfat conținând 150 mM de clorură de sodiu (soluție salină tamponată cu fosfat, pH 7,0) înainte de analiză. Toate probele de sânge au fost diluate în mod similar 1:10 cu soluție salină tamponată cu fosfat (pH 7,0). Probele de urină au fost, de asemenea, diluate 1:20 cu soluție salină tamponată cu fosfat 100 mM (pH 7,0). Calibratorii și probele au fost apoi pipetați în dublu exemplar în godeurile plăcii de microtitrare, folosind o dimensiune a probei de 10 μL atât pentru urină, cât și pentru sânge. Aceasta a fost urmată de adăugarea a 100 μL de conjugat enzimatic constând în difenhidramină marcată cu HRP. Plăcuța a fost apoi lăsată la incubat timp de 1 h în întuneric, la temperatura camerei. Apoi, godeurile au fost spălate de șase ori cu 350 μL de apă deionizată cu ajutorul unui dispozitiv de spălare a plăcilor de microtitrare, au fost aspirate pentru a elimina apa, apoi au fost inversate și uscate cu o palmă pentru a elimina apa reziduală din godeuri. Substratul cromogenic TMB (100 μL) a fost apoi adăugat în fiecare fântână, iar placa a fost incubată timp de încă 30 de minute la întuneric. Reacția a fost apoi oprită cu 100 μl de acid clorhidric 1 N, pentru a produce o culoare galbenă. Testul este colorimetric, iar absorbția a fost citită la o lungime de undă dublă de 450 nm și 650 nm cu ajutorul unui cititor de plăci de microtitrare. Lungimea de undă de 650 nm măsoară absorbția de fond, pe care cititorul de plăci o scade apoi din absorbția finală. Intensitatea culorii produse este invers proporțională cu concentrația de analit din probă.

LC-MS-MS. Pentru analiză s-a folosit o pompă LC din seria 1200 cuplată la un MS 6410 triplu-cadrupol care funcționează în modul de ionizare prin electrospray pozitiv (ESI). Coloana LC-MS-MS utilizată a fost o coloană Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Proba pentru analiză a fost pregătită după cum urmează: o probă de urină de 100 μl care conținea 50 μl de difenhidramină-d3 (200 ng/mL) a fost adăugată într-un flacon autosampler. Probele au fost injectate direct în LC-MS-MS prin intermediul unui autoinjector. Temperatura coloanei a fost menținută la 60°C, iar volumul de injecție a fost de 5 µL. Faza mobilă a fost compusă din acid acetic 0,2% pH 4 (solvent A) și metanol (solvent B). Inițial, compoziția fazei mobile a fost de 100% A la un debit de 0,7 ml/min pe o perioadă de 6 min, apoi procentul de metanol a fost mărit la 100%, după care s-a revenit din nou la 100% A după 7 min.

Temperatura gazului a fost de 350°C, debitul de gaz a fost de 10 L/min, iar presiunea nebulizatorului a fost menținută la 50 psi. Azotul a fost utilizat ca gaz de coliziune, iar tensiunea capilară a fost de 4000V. Au fost selectate și optimizate două tranziții pentru fiecare medicament. Timpul de așteptare a fost de 50 ms, iar energia optimă a fragmentorului a fost de 80V pentru toate tranzițiile. Tensiunile optime ale energiei de coliziune au fost determinate ca fiind de 35V pentru standardul intern deuterat (difenhidramină-d3), 15V pentru tranziția primară și 30V pentru tranziția secundară pentru difenhidramină însăși. Raportul dintre tranziția de calificare și tranziția de cuantificare a fost determinat la aproximativ punctul median al intervalului de calibrare: 100 ng/mL. Tranziția pentru difenhidramină-d3 a fost 259,7 > 165,2; tranziția primară (cuantificatoare) pentru difenhidramină a fost 256,7 > 167,2; tranziția calificativă (secundară) 256,7 > 152,2. Difenhidramina neetichetată se poate descompune în ioni produs de m/z 167 sau 165 din ionul precursor, în funcție de energia de coliziune aplicată. Procedura noastră a fost validată folosind condițiile descrise. Limita de detecție (LOD) a metodei LC-MS-MS a fost de 10 ng/mL și a fost determinată ca fiind cea mai mică concentrație detectabilă cu un raport semnal/zgomot > 2.

Rezultate și discuții

Curba doză-răspuns

Metoda utilizează legarea competitivă între conjugatul enzimatic și analitul liber din probă pentru o cantitate fixă de situsuri de legare a anticorpilor, proporțională cu concentrația acestora în amestec. Curbele doză-răspuns pentru DPH au fost pregătite în urină sintetică negativă și sânge sintetic negativ la concentrațiile descrise anterior. B0 este absorbanța calibratorului negativ, iar B reprezintă absorbanța nivelurilor individuale ale calibratorului. Raportul procentual dintre calibratorul individual și calibratorul negativ (B/B0) a fost calculat pentru fiecare nivel de calibrator și reprezentat grafic în funcție de concentrația de medicament (ng/mL) atât pentru urină, cât și pentru sânge (figura 3). Valorile B/B0 sunt invers proporționale cu concentrația de medicament din probă, motivul fiind acela că, cu cât concentrația de medicament este mai mare, cu atât mai puțin conjugat medicament-enzimă se leagă de anticorp, producând astfel o valoare mai mică a absorbanței.

Ecantioane autentice

Pentru a valida testul, au fost obținute probe de urină la momente diferite, pe o perioadă de o săptămână, de la cinci voluntari care sunt utilizatori terapeutici obișnuiți de difenhidramină din cauza simptomelor alergice comune. Toți cei cinci voluntari au fost rugați să completeze un chestionar în care să precizeze toate medicamentele pe care le iau și s-a observat că nu au fost enumerate alte medicamente. Au fost colectate 20 de probe, care au fost mai întâi examinate prin ELISA și apoi confirmate cu ajutorul LC-MS-MS. Toate probele de urină au fost pre-diluate în proporție de 1:20 cu soluție salină tamponată cu fosfat 100 mM (pH 7,0) înainte de efectuarea testului ELISA. Șase specimene s-au dovedit a fi negative prin ambele metode, în timp ce 14 specimene au fost pozitive prin ELISA, dintre care 1 specimen a fost confirmat ca fiind negativ prin LC-MS-MS. Acest lucru s-ar putea datora faptului că cantitatea de DPH prezentă în acel eșantion, așa cum a fost găsită prin LC-MS-MS, era aproape de pragul de 50 ng/mL. S-a constatat că probele de urină pozitive conțineau DPH la niveluri cuprinse între 60 și 700 ng/mL. Zece probe de urină de control au fost, de asemenea, pregătite prin fortificarea urinei sintetice negative cu concentrații pozitive scăzute și ridicate de difenhidramină și analizate în continuare în cadrul testului. Rezultatele au fost toate pozitive prin ELISA și s-au corelat cu datele de confirmare LC-MS-MS ale acestora.

Pentru validarea testului în sânge au fost utilizate probe postmortem. Douăzeci de eșantioane de sânge postmortem au fost obținute de la laboratorul LA County Coroner’s. Toate probele de sânge au fost pre-diluate 1:10 cu soluție salină tamponată cu fosfat 100 mM (pH 7,0) înainte de analiză. Toate cele 20 de probe au fost depistate pozitiv prin ELISA și au fost comparate cu datele de confirmare GC-MS ale acestora, furnizate, de asemenea, de laboratorul medicului legist, care au arătat că acestea conțin o gamă largă de concentrații de DPH între < 100 și 870 ng/mL. Deși un specimen a confirmat mai puțin decât limita de cuantificare GC-MS de 100 ng/mL, DPH a fost totuși identificat cu ajutorul procedurii ELISA. Scopul acestui studiu a fost de a valida metoda ELISA cu o procedură de confirmare cunoscută și nu de a încerca interpretarea concentrațiilor. Concluzia acestui studiu este că testul ELISA este capabil să detecteze niveluri terapeutice de DPH, precum și niveluri postmortem mult mai ridicate și, prin urmare, ar putea fi utilizat cu ușurință în scopul depistării DUID, precum și în cazurile de deces.

Concluzii

DPH este un medicament fără prescripție medicală care a fost asociat cu numeroase accidente legate de condus, precum și cu decese. Așadar, un screening ELISA ar fi util pentru a determina prezența medicamentelor fără prescripție medicală, cum ar fi antihistaminicele, în probele obținute în situații legate de condus. Această lucrare descrie dezvoltarea unei metode de screening ELISA foarte sensibile și specifice pentru difenhidramină atât în matrici de urină, cât și de sânge, cu o precizie <10%. După cunoștințele autorilor, aceasta este prima metodă de imunodozare dezvoltată pentru detectarea DPH în fluidele corporale umane. Această metodă respectă orientările recomandate privind un prag de 50 ng/mL în urină și 25 ng/mL în sânge pentru cazurile de DUID. Validitatea metodei a fost, de asemenea, verificată cu probe autentice de urină și sânge, iar datele ELISA au fost corelate cu rezultatele confirmării LC-MS-MS și GC-MS. Chiar dacă unele dintre probele analizate proveneau din cazuri post-mortem, rezultatele obținute de la acestea, combinate cu LOD-ul scăzut al testului, demonstrează în mod clar aplicabilitatea testului la cazurile de afectare pe marginea drumului, unde ar putea fi detectate cantități mai mici de DPH. S-a observat un anumit grad de reactivitate încrucișată cu anumiți compuși triciclici care sunt similari din punct de vedere structural cu DPH; cu toate acestea, orice rezultate fals pozitive rezultate din astfel de compuși ar fi eliminate în etapa de confirmare. Trebuie efectuate studii suplimentare pentru a elimina problemele de reactivitate încrucișată cu compușii triciclici și pentru a o îmbunătăți pe cea cu antihistaminicele similare.

Recunoștințe

Această lucrare a fost susținută prin finanțare din partea Immunalysis Corporation. Dorim să le mulțumim doctorului James Soares și domnului Michael Vincent pentru discuțiile pătrunzătoare din timpul pregătirii acestui manuscris, doamnei Cynthia Coulter pentru analiza LC-MS-MS a probelor de urină și domnului Dan Anderson de la laboratorul LA County Coroner’s pentru furnizarea de probe de sânge pozitive. De asemenea, dorim să mulțumim tuturor voluntarilor care au furnizat probe de urină.

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

,

,

,

.

,

,

, vol.

(pag.

–

)

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

.

,

,

, vol.

,

,

.

,

,

, vol.

(pg.

–

)

,

,

Jr.