Celule stem din lichidul amniotic și membrana amniotică: Marker Discovery

Abstract

Lichidul amniotic (AF) și membrana amniotică (AM) au fost recent caracterizate ca surse promițătoare de celule stem sau progenitoare. Ambele conțin nu numai subpopulații cu caracteristici de celule stem asemănătoare celulelor stem adulte, cum ar fi celulele stem mezenchimale, dar prezintă, de asemenea, unele proprietăți ale celulelor stem embrionare, cum ar fi (i) exprimarea markerilor de pluripotență, (ii) expansiunea ridicată in vitro sau (iii) capacitatea de diferențiere multilineală. Eforturile recente s-au concentrat asupra izolării și caracterizării detaliate a acestor tipuri de celule stem. Cu toate acestea, variațiile în fenotipul lor, eterogenitatea lor descrisă de diferite grupuri și absența unui singur marker exprimat numai în aceste celule pot împiedica izolarea unei populații pure și omogene de celule stem din aceste surse și utilizarea potențială a acestor celule în aplicații terapeutice. În această lucrare, ne propunem să rezumăm progresele recente în descoperirea de markeri pentru celulele stem derivate din surse fetale, cum ar fi AF și AM, utilizând metodologii noi bazate pe analize transcriptomice, proteomice sau secretomice.

1. Introducere

Atât lichidul amniotic (AF), cât și membrana amniotică (AM) reprezintă surse bogate de celule stem care pot fi utilizate în viitor pentru aplicații terapeutice clinice. Preocupările de ordin etic cu privire la izolarea celulelor stem din aceste surse sunt reduse la minimum , spre deosebire de problemele apărute în urma cercetărilor cu celule stem embrionare umane (CSE) . AF este colectată în timpul amniocentezelor programate între a 15-a și a 19-a săptămână de gestație pentru diagnosticul prenatal, iar surplusul de probă poate fi utilizat pentru obținerea de celule, în timp ce AM este colectată, de obicei, în timpul operațiilor cezariene în cazul sarcinilor la termen. Având în vedere eterogenitatea populațiilor de celule stem derivate din aceste surse, izolarea unor tipuri de celule specifice este dificilă și necesită o caracterizare fenotipică și moleculară detaliată a celulelor respective. Studiile care includ abordări omice sunt fundamentale pentru o mai bună înțelegere a mecanismelor de expresie moleculară a acestor celule și pentru definirea metodologiilor corecte de izolare a acestora, înainte de utilizarea lor în abordări terapeutice.

Acest articol își propune să prezinte principalele caracteristici biologice și moleculare ale celulelor stem derivate din AF și AM și, de asemenea, să evidențieze progresele recente în descoperirea de markeri folosind metodologii globale, cum ar fi analizele transcriptomice, proteomice sau secretomice.

1.1. Lichidul amniotic

AF servește ca lichid protector pentru embrionul în curs de dezvoltare, asigurând suportul mecanic și nutrienții necesari în timpul embriogenezei . Amniocenteza a fost utilizată timp de multe decenii ca procedură de rutină pentru cariotiparea fetală și diagnosticul prenatal, permițând detectarea unei varietăți de boli genetice .

Componenta principală a AF este apa; cu toate acestea, compoziția sa globală variază pe parcursul sarcinii. La începutul sarcinii, osmolaritatea amniotică este similară cu cea a plasmei fetale. După keratinizarea pielii fetale, osmolaritatea amniotică scade relativ față de plasma maternă sau fetală, în principal datorită afluxului de urină fetală . Mai interesant este faptul că AF reprezintă, de asemenea, o sursă bogată de populație de celule stem provenite fie din fetus, fie din membrana amniotică înconjurătoare . Cercetări suplimentare efectuate de mai multe grupuri s-au concentrat recent asupra proprietăților celulare ale celulelor derivate din amnioză și asupra utilizării lor potențiale în modelele preclinice și în terapiile de transplant .

1.1.1.1. Celulele stem din lichidul amniotic (AFSCs)

Celele din lichidul amniotic (AFCs) reprezintă o populație eterogenă derivată din cele trei straturi germinative. Aceste celule au o origine epitelială comună și sunt derivate fie din embrionul în curs de dezvoltare, fie din suprafața internă a membranei amniotice, care sunt caracterizate ca celule stem de membrană amniotică . AFC-urile sunt compuse în principal din trei grupuri de celule aderente, clasificate pe baza caracteristicilor lor morfologice, de creștere și biochimice . Celulele epitelioide (de tip E) sunt celule cuboidale sau columnare derivate din pielea și urina fetală, celulele din lichidul amniotic (de tip AF) provin din membranele fetale, iar celulele fibroblastice (de tip F) sunt generate în principal din țesutul conjunctiv fibros. Atât celulele de tip AF, cât și cele de tip F au în comun o morfologie fibroblastoidă, iar tipul celular dominant pare a fi cel de tip AF, care coexprimă keratine și vimentine . Mai multe studii au documentat faptul că celulele stem din lichidul amniotic uman (AFSC) pot fi obținute cu ușurință dintr-o cantitate mică de AF din al doilea trimestru, colectată în timpul amniocentezelor de rutină , o procedură cu o rată de avort spontan cuprinsă între 0,06 și 0,5% . Până în prezent, au fost raportate o serie de protocoale de cultivare diferite, care au condus la populații de celule stem îmbogățite. Izolarea AFSC și protocoalele de cultură respective au fost rezumate într-o recenzie recentă de Klemmt et al. și pot fi clasificate după cum urmează: (i) un protocol de cultivare într-o singură etapă, în care cultura primară a fost lăsată netulburată timp de 7 zile sau mai mult până la apariția primelor colonii , (ii) un protocol de cultivare în două etape, în care amniocitele, care nu s-au atașat după 5 zile de cultură, au fost colectate și extinse în continuare , (iii) selectarea markerilor de suprafață celulară pentru CD117 (receptor c-kit) , (iv) izolarea mecanică a coloniilor inițiale de celule progenitoare mezenchimale formate în culturile inițiale și (v) culturi de scurtă durată pentru a izola coloniile fibroblastoide . Majoritatea AFSCs, izolate în urma acestor metodologii, au împărtășit un fenotip mezenchimal multipotent și au prezentat un potențial de proliferare mai mare și un potențial de diferențiere mai larg în comparație cu MSCs adulte .

1.2. Membrana amniotică (AM)

Membrana amniotică, lipsită de orice țesut vascular, formează cea mai mare parte a stratului intern al membranei fetale și este compusă din 3 straturi: (i) un monostrat epitelial format din celule epiteliale, (ii) un strat bazal intermediar acelular și (iii) un strat extern de celule mezenchimale, bogat în celule stem mezenchimale și plasat în imediata apropiere a corionului . AM a fost utilizat în clinică timp de mai multe decenii pentru vindecarea rănilor în cazul arsurilor, promovând formarea epiteliului și protejând împotriva infecțiilor . Recent, utilizarea AM a fost evaluată ca material de pansament pentru defecte chirurgicale ale mucoasei orale , reconstrucția suprafeței oculare , perforații corneene și augmentarea vezicii urinare .

1.2.1. Celule stem de membrană amniotică (AMSCs)

Celulele stem de membrană amniotică (AMSCs) includ două tipuri, celulele epiteliale amniotice (AECs) și celulele stem mezenchimale de membrană amniotică (AM-MSCs) derivate din stratul epitelial amniotic și, respectiv, din stratul mezenchimal amniotic . Ambele tipuri de celule își au originea în timpul etapelor de pregastrulare a embrionului în curs de dezvoltare, înainte de delimitarea celor trei straturi germinative primare și sunt în cea mai mare parte de natură epitelială . Au fost stabilite o varietate de protocoale pentru izolarea CEA și CSM-AM, bazate în principal pe separarea mecanică a AM de membrana corionică și pe digestia enzimatică ulterioară . AM-MSC au prezentat o aderență plastică și o morfologie fibroblastoidă, în timp ce AEC au prezentat un fenotip epitelial de tip cobblestone. AM-MSC au împărtășit caracteristici fenotipice similare cu cele derivate din surse adulte. Mai interesant, AM-MSCs, la fel ca AF-MSCs, au prezentat o rată de proliferare mai mare în comparație cu MSCs derivate din surse adulte și un potențial de diferențiere multilineală în celule derivate din cele trei straturi germinale .

2. Imunofenotip

2.1. Imunofenotipul

2.1. Celule stem din lichidul amniotic

Fluidul amniotic a apărut recent ca o sursă fetală alternativă a unei varietăți de celule de origine stem . În acest caz, ne propunem să rezumăm markerii cheie care caracterizează AFSCs. Până în prezent, MSCs reprezintă cea mai bine caracterizată subpopulație de AFSCs. AF-MSC au prezentat o expresie tipică a markerilor mezenchimali, cum ar fi CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 și CD44, determinată prin analize de citometrie de flux . În plus, aceste celule au exprimat antigenele HLA-ABC, în timp ce expresia markerilor hematopoietici CD34 și CD45, a markerului endotelial CD31 și a antigenului HLA-DR nu a fost detectată. Mai important, majoritatea AF-MSC cultivate au exprimat markeri de pluripotență, cum ar fi proteina de legare a octamerului 3/4 (Oct-3/4), factorul de transcripție homebox Nanog (Nanog) și antigenul embrionar specific stadiului 4 (SSEA-4) .

S-a raportat, de asemenea, că culturile de amniocite conțin o mică populație de celule CD117 (o tirozină kinază specifică factorului de celule stem prezentă în principal în CSE și în celulele germinale primordiale) pozitive care pot fi extinse clonal în cultură . Proprietățile de diferențiere ale AFS CD117+ au fost testate pentru prima dată in vivo, dovedind în acest fel identitatea lor de celule stem . Dovezile experimentale au sugerat că AFSC derivă din celule fibroblastoide cu formă fusiformă .

În încercarea de a analiza subpopulațiile de AFSC, grupul nostru a identificat recent două populații morfologic distincte de AFSC de origine mezenchimală, cu proprietăți diferite de proliferare și diferențiere, denumite în formă fusiformă (SS) și în formă rotundă (RS) . Ambele subpopulații exprimau markerii celulelor stem mezenchimale la niveluri similare. Cu toate acestea, s-a identificat că coloniile SS exprimau niveluri mai ridicate de antigene CD90 și CD44 în comparație cu coloniile RS .

2.2. Celule stem de membrană amniotică (AMSCs)

O analiză detaliată a imunofenotipului AMSCs a evidențiat expresia antigenelor, cum ar fi CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , markerul celulelor stem stromale 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, colagenul I și III (Col1/Col3), alfa-actina musculară lină (α-SMA), CD44, vimentina (Vim), proteina de suprafață a fibroblastelor (FSP) și antigenul HLA-ABC . Cu toate acestea, molecula de adeziune intercelulară 1 (ICAM-1) a fost exprimată la niveluri foarte scăzute, iar proteinele TRA-1-60, proteina de adeziune a celulelor vasculare 1 (VCAM-1), factorul von Willebrand (vWF), molecula de adeziune a celulelor endoteliale plachetare (PECAM-1), CD3 și HLA-DR nu au fost detectate . Una dintre cele mai abundente proteine găsite în celulele derivate din AM este laminina, care joacă un rol-cheie în diferențiere, forma și migrarea celulelor și regenerarea țesuturilor . Analiza RT-PCR a arătat, de asemenea, că AMSC au exprimat gene, cum ar fi Oct-3/4, proteina zinc finger 42 (zfp42 sau Rex-1), proteina factorului de celule stem (SCF), molecula de adeziune a celulelor neuronale (NCAM), nestin (NES), proteina morfogenetică osoasă 4 (BMP-4), proteina de legare GATA 4 (GATA-4) și factorul nuclear hepatocitar 4α (HNF-4α) chiar și în treceri mari. Nu au fost detectate transcripțiile Brachyury, a factorului de creștere a fibroblastului 5 (FGF5), a proteinei paired box (Pax-6) și a proteinei morfogenetice osoase 2 (BMP2) . În mod similar, AECs au fost pozitive pentru CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC și negative pentru expresiile CD14, CD34, CD45, CD49d și HLA-DR, așa cum au fost determinate de analizele FACS . O investigație suplimentară a arătat că AECs exprimau markeri de celule stem, cum ar fi SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, regiunea de determinare a sexului Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 și Tra1-80, factorul de creștere a fibroblastelor 4 (FGF4), Rex-1, proteina criptică (CFC-1) și prominina 1 (PROM-1) .

3. Transcriptomică

3.1. Celulele stem din lichidul amniotic

O analiză funcțională a semnăturii de expresie genetică a AF-MSC în comparație cu celulele stem din măduva osoasă (BM-), din sângele de cordon (CB-) și AM-MSC a fost realizată inițial de Tsai et al. . Genele exprimate în MSC din toate cele trei surse au putut fi clasificate în grupuri legate de (i) remodelarea matricei extracelulare (CD44, colagen II (COL2), factor de creștere asemănător insulinei 2 (IGF2), și inhibitorul tisular al metaloproteinazei 1 (TIMP1)), (ii) reglarea citoscheletului (activatorul de plasminogen de tip urokinază (PLAU) și receptorul (PLAUR)), (iii) reglarea chemokinei și aderența (alfa actinina 1 (ACTN1), subunitatea 1B a complexului proteic legat de actină (ARPC1B) și trombospondina 1 (THBS1)), (iv) activarea plasminei (inhibitorul 2 al căii factorului tisular (TFPI2)), (v) semnalizarea receptorului factorului de creștere transformant β (TGFβ) [caveolina 1 (Cav1), caveolina 2 (Cav2), inhibitorul 1A al kinazei dependente de ciclină (CDKN1A)] și (vi) genele care codifică ubiquitin ligaze E3 (SMURF) . Genele care au fost suprareglementate în AF-MSC în comparație cu BM-, CB- și AM-MSC au inclus molecule implicate în maturarea și contracția uterină, cum ar fi receptorul de oxitocină (OXTR) și reglarea sintezei de prostaglandine, cum ar fi fosfolipază A2 (PLA2G10). Alte gene suprareglementate din acest grup au fost implicate în transducția semnalelor legate de (i) răspunsul declanșat de trombină ((F2R și F2RL)), (ii) semnalizarea hedgehog ((aciltransferaza hedgehog (HHAT)) și (iii) căile legate de proteinele G (proteina de legare a GTP legată de rho (RHOF), regulatorul semnalizării proteinelor G 5 și 7 (RGS5, RGS7) și fosfolipaza C beta 4 (PLCB4)) .

În studiile recente privind AFSC, Kim et al. au descris pentru prima dată modificările expresiei genice în populația totală de AFSC în timpul diferitelor treceri prin analiza cu microarray illumina. Au fost detectate 1970 de gene exprimate diferențiat și clasificate în funcție de profilurile lor de expresie în 9 clustere distincte . Genele cu niveluri de expresie în creștere treptată au inclus chemokine (C-X-C motiv) ligand 12 (CXCL12), cadherina 6 (CDH6) și receptorul de folat 3 (FOLR3). Genele care au scăzut au fost, printre altele, ciclina D2 (CCND2), cheratina 8 (K8), IGF2, precursorul peptidei natriuretice (BNP) B și proteina 2 de legare a acidului retinoic celular (CRABPII) . Pentru a obține informații suplimentare, a fost efectuată o analiză a datelor de cip privind genele de îmbătrânire și a evidențiat o creștere a transcripțiilor genice, cum ar fi factorul de creștere nervoasă beta (NGFβ), substratul receptorului de insulină 2 (IRS-2), proteina de legare a factorului de creștere asemănător insulinei 3 (IGFBP-3) și apolipoproteina E (APOE). Expresia unor gene, cum ar fi PLAU, factorul de transcripție E2F 1 (E2F1), IGF2, gena de susceptibilitate la cancerul de sân de tip 1 (BRCA1), ADN topoizomeraza 2-alfa (TOP2A), antigenul nuclear al celulelor proliferante (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), gena cyclin-A2 (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog 1 beta (BUB1B) și cyclin dependent kinase 1 (CDC2), a fost treptat reglată în jos în timpul culturii .

Wolfrum et al. au efectuat o analiză globală a expresiei genice a AFSCs în comparație cu iPSCs derivate din AF (AFiPSC) și ESCs . Dintre acestea, genele legate de autoreînnoire și pluripotență (1299 gene, de exemplu, POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, proteina de legare a microARN-ului LIN28) și specificitatea AFSCs (665 gene, de ex, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatoza de tip 2 (NF2), protectina (CD59), membrul 10 al superfamiliei factorului de necroză tumorală (TNFSF10), 5′-nucleotidaza (NT5E)) au fost detectate în AFSCs . Mai mult decât atât, autorii au examinat expresia senescenței și a genelor asociate telomerilor în AFSC de trecere timpurie și ulterioară, pentru a studia efectul reprogramării asupra ocolirii senescenței observate în culturile de AFSC. Șaizeci și patru de gene au fost identificate ca fiind exprimate diferențiat în AFSCs în comparație cu liniile AFiPSC. Dintre acestea, genele asociate telomerilor și genele implicate în reglarea ciclului celular, cum ar fi genele mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), poli ADP-riboză polimeraza 1 (PARP1), proteina de replicare A3 (RPA3), dyskeratosis congenita 1 (DKC1), mutS omolog 6 (MSH6), omologul CHK1 checkpoint (CHEK1), polo-like kinaza 1 (PLK1), genele POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), CDC2, CDC2, gena sindromului Bloom RecQ helicase-like (BLM), gena sindromului Werner RecQ helicase-like (WRN), ADN metiltransferaza 1 (DNMT1), ADN metiltransferaza 3 beta (DNMT3B), lamin B1 (LMNB1) și factorul 1 de replicare a ADN-ului (CDT1), au fost reglate în AFSC în comparație cu AFiPSC și ESC. În schimb, peptidilprolyl cis/trans izomeraza (PIN1), lamin A/C (LMNA), growth arrest and DNA damage inducible alpha (GADD45A), chromobox homolog 6 (CBX6), NADPH oxidase 4 (NOX4), endoglin (ENG), histona H2B de tip 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A factorul de diferențiere a creșterii 15 (GDF15) și inhibitorul 1 al serin proteazei (SERPINE1), printre altele, au fost suprareglementate în AFSCs în comparație cu AFiPSCs și ESCs .

3.2. Celule stem de membrană amniotică

Analiza transcriptomică utilizând microplăci de ADN a fost raportată pentru AM-MSCs . Aceste date experimentale au furnizat informații cu privire la modelul de expresie genetică al AM-MSC în comparație cu profilurile de expresie genetică ale AF, CB și BM-MSC. Au fost identificate mai multe gene suprareglementate în AM-MSCs implicate în reglarea adaptării imune între interfața maternoplacentară. Printre altele, s-a constatat că spondina 2 (SPON2), interferonul, proteina inductibilă alfa 27 (IFI27), receptorul B1 al bradikininei (BDKRB1), membrul 5 și 6 al subfamiliei B de citokine mici inductibile (SCYB5, SCYB6) și omologul oncogenei legate de virusul sarcomului Yamaguchi (LYN) au fost suprareglementate. În plus, alte gene cu o expresie crescută în AM-MSC în comparație cu AF, CB și BM-MSC au inclus (i) factori de transcripție, cum ar fi forkhead box F1 (FOXF1), heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2) și factorul de transcripție 21 (TCF21) și (ii) enzime metabolice, cum ar fi dipeptidil-peptidaza 6 (DPP6), triptofan 2,3-dioxigenază (TDO2) și sialiltransferaze (STs) .

4. Proteomica

4.1. Celulele stem din fluidul amniotic

Studii proteomice asupra populației totale de AFSC, inclusiv celule epitelioide (tip E), specifice fluidului amniotic (tip AF) și fibroblastice (tip F), au evidențiat 2400 de spoturi care au dus la identificarea a 432 de produse genetice diferite. Majoritatea proteinelor a fost localizată în citoplasmă (33%), mitocondrii (16%) și nucleu (15%) și a reprezentat în principal enzime (174 de proteine) și proteine structurale (75 de proteine). De asemenea, a fost prezent un procent relativ ridicat de proteine membranare și asociate cu membrana (7%) . Dintre proteinele detectate, 9 corespundeau celulelor epiteliale, cum ar fi ATP sintetaza lanțului D (ATP5H), NADH-ubichinonă oxidoreductaza subunitatea 30 kDa (NUIM), anexina II (Anx2), anexina IV (Anx4), proteina ribozomală 40S SA (Rpsa), glutation S-transferaza P (GSTP), proteina de boltă majoră și citokeratinele 19 și 7 (CK-19, CK-7), în timp ce 12 proteine au fost raportate ca fiind exprimate în fibroblaste, inclusiv fibronectinele, tropomiozinele, transgelina (TAGLN), subunitatea de 34 kDa a complexului arp2/3 (P34-arp), gelsolina (Gsn), factorul de alungire 1-β (EF-1β) și altele. S-a constatat că opt proteine sunt exprimate în keratinocite, inclusiv keratinele, ribonucleoproteinele, Anx2, aetyl-CoA acetil-transferaza (ACAT1) și altele, trei sunt exprimate în epidermă, inclusiv tropomiozinele și keratinele și una în tipul de celule mezenchimale (vimentina 1 (Vim 1)) .

Studii recente au furnizat dovezi că o diversitate a expresiei enzimelor metabolice în celulele amnezice este implicată în sindroame metabolice și genetice și, astfel, detectarea lor ar putea fi importantă pentru diagnosticul prenatal. O analiză mai detaliată pentru determinarea enzimelor metabolice specifice prezente în AFSCs a fost raportată de Oh et al. . Nouăzeci și nouă de proteine au fost identificate, cum ar fi enzimele de manipulare a carbohidraților, enzimele de manipulare a aminoacizilor, proteinele metabolismului purinic și enzimele metabolismului intermediar .

O analiză proteomică a fost, de asemenea, efectuată pe diferite treceri de cultură ale AFSC-urilor CD117+, prezentând variații în expresia proteinelor care au avut loc în principal în primele treceri . Douăzeci și trei de proteine au fost exprimate diferențiat între pasajele timpurii și cele târzii, cu cele mai lipite proteine downregulate, Col1, Col2, vinculin (Vcl), CRABP II, stathmin (STMN1) și cofilin-1 (CFL1). În schimb, TAGLN și Col3 sunt crescute în timpul pasajelor . Proteinele care au prezentat niveluri dereglate de-a lungul pasajelor au fost subunitatea 7 de reglare a proteazei 26S (PSMD7), izoenzima L1 a hidrolazei ubiquitin-carboxil terminale (UCH-L1), proteina nucleară heterogenă ribonucleară H (hnRNP H) și proteina 43 de legare a ADN-ului TAR (TDP-43) .

În 2007, harta proteomică a AF-MSC umane a fost construită și comparată direct cu cea derivată din BM-MSC . În AF-MSCs au fost identificate 261 de proteine diferite, majoritatea proteinelor fiind localizate în citoplasmă (41%), în timp ce altele au fost găsite în reticulul endoplasmatic (8%), nucleu (13%), mitocondrii (12%), ribozomi (1%), citoschelet (6%), citoplasmă și nucleu (5%) și proteine secretate (2%) . AF-MSC au exprimat o serie de proteine legate de proliferare și de menținerea celulelor, cum ar fi ubiquilina-1 (UBQLN1), despre care se știe că controlează progresia ciclului celular și creșterea celulară, proteina asociată proliferării 2G4 (PA2G4), o proteină nucleară care reglează creșterea nucleară, proteina secretată acidă și bogată în cisteină (SPARC), care este reglată în timpul embriogenezei și este implicată în controlul ciclului celular și al adeziunii celulare, precum și enhancerul omologului rudimentar (ERH) care reglează, de asemenea, ciclul celular . TAGLN și galectina 1 (Gal 1), ambele prezente în celulele stem și legate de diferențiere, au fost, de asemenea, exprimate din abundență în AF-MSCs. Alte proteine exprimate la niveluri ridicate în AF-MSCs au fost legate de (i) dezvoltare, cum ar fi Deltex-3-like (DTX3L), și (ii) organizarea și mișcarea citoscheletului, cum ar fi CFL1, proteina asemănătoare coactosinei (CLP) și omologul proteinei abilitate (Enah). Așa cum era de așteptat, Vim a fost, de asemenea, exprimată în cantități mari în AF-MSC. În acest studiu, a fost descrisă, de asemenea, o comparație detaliată a proteinelor comune identificate în celulele AF și AF-MSCs .

În studiul nostru ulterior , am stabilit harta proteomică a celor două tipuri de celule progenitoare mezenchimale AF distincte din punct de vedere morfologic (SS și RS) prin 2-DE. Douăzeci și cinci de proteine au fost exprimate diferențiat în cele două subpopulații. Proteinele care au crescut în SS-AF-MSC în comparație cu RS-AF-MSC au inclus precursorul reticulocalbinei-3 (RCN3), colagenul α1 (I) (COL1α1), precursorul proteinei de legare a FK506 9 (FKBP9), inhibitorul de disociere Rho GDP 1 (RhoGDI), proteina canalului intracelular de clorură 4 (CLIC4), triptofanil-ARNt sintetaza (TrpRS) și proteina șocului termic 70 kD (HSP70). Peroxiredoxina 2 (Prdx2), proteina de șoc termic de 60 kD (HSP60), GSTP și Anx4 au fost suprareglementate în RS-AFMPCs. Cu toate acestea, proteinele identificate în RS-AF-MSC au inclus doar citokeratina-8, -18 și -19 (CK-8, -18 și CK-19), catepsina B (CTSB), CLP și proteina integrin αV (CD51). Proteinele legate de mezenchimal, cum ar fi Vim, Gal, Gsn și prohibitina (PHB), au fost exprimate la aceleași niveluri în ambele populații .

4.2. Celule stem de membrană amniotică

O abordare detaliată pentru studierea proteinelor AM umane a fost descrisă de Hopkinson și colab. . În acest studiu, autorii au efectuat o analiză proteomică a probelor de AM care au fost pregătite pentru transplantul uman, prin utilizarea de geluri 2-DE. De asemenea, au fost examinate mediile de spălare din probele AM și au fost identificate proteinele secretate. Proteinele detectate atât în AM, cât și în mediile de spălare au sugerat că a avut loc o eliberare parțială a proteinelor. Aceste proteine erau în cea mai mare parte proteine citoplasmatice solubile și au fost clasificate în funcție de localizarea și funcția lor subcelulară. Un exemplu dintre cele mai abundente și mai consistente proteine din AM este THBS1, despre care s-a raportat că joacă un rol în repararea rănilor, în răspunsul inflamator și în angiogeneză . Mimecan (denumită și osteoglicină/OGN) este o altă proteină detectată în AM care reprezintă un mic proteoglican bogat în leucină, care se găsește în ECM a țesutului conjunctiv. S-a raportat că mimecanul menține rezistența la tracțiune și hidratarea țesutului . În plus, forma mai mare de mimecan a fost exprimată în celulele AM și a fost susceptibilă la scindare proteolitică . Proteina indusă de TGF-β ig-h3 (βIG-H3), o moleculă adezivă a ECM care acționează ca un factor de creștere asociat membranei în timpul diferențierii celulare și al vindecării rănilor, și intergrina α6 (CD49f), o componentă a integrinei α6β4, au fost, de asemenea, prezente în cantități semnificative în celulele AM . Este bine cunoscut faptul că interacțiunea α6β4-βIG-H3 joacă un rol important în medierea căilor de semnalizare a adeziunii celulare și a reparării rănilor .

Un alt studiu important realizat de Baharvand et al. s-a axat pe analiza AM uman denudat cu epiteliu, arătând atât diferențe cantitative cât și calitative în comparație cu AM netratat . Ei au investigat proteomul epiteliului AM uman, care a fost folosit ca nișă de celule stem limbale pentru tratarea reconstrucției suprafeței oculare . 515 pete au fost detectate în toate gelurile 2-DE și 43 de proteine au fost identificate cu ajutorul MALDI TOF/TOF MS în AM. Cele mai abundente proteine au fost diferite izoforme de lumican (LUM) și OGN, ambele membre ale familiei de proteoglicani (PG). În special, OGN ar putea juca un rol în multe procese biologice, inclusiv în creșterea celulară, angiogeneza și inflamația. Alte proteine detectate au inclus colagenul VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), lanțul beta al fibrinogenului (FGB), transglutaminaza 2 izoforma A (TGM2A), varianta b-actinei (ACTB), proteina de șoc termic 5 (HSPA5) de 70 kD, nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 și nefrita tubulointerstițială (TIN) . Unele dintre proteinele identificate în acest studiu au fost, de asemenea, legate de matricea extracelulară (ECM). Dintre cele detectate, s-a raportat că fibronectina (FN), lamininele și colagenul IV (Col4) și VII promovează aderența și migrația epitelială .

5. Secretomul

Recent, s-au făcut progrese semnificative în ceea ce privește analiza proteinelor secretate de AFSC. A fost documentat faptul că secretomul AFSC a fost responsabil pentru intensificarea vasculogenezei și a fost capabil să evoce un răspuns angiogenic puternic la primitorii murini . Conform acestui studiu, o analiză detaliată a mediului condiționat de AFSC a dezvăluit prezența unor factori proangiogeni și antiangiogeni cunoscuți, utilizând tehnologia MAP de la Luminex. Factorul de creștere a endoteliului vascular (VEGF), factorul 1 derivat din celulele stromale (SDF-1), interleukina 8 (IL-8), proteina 1 chemotactică a monocitelor (MCP-1) și doi inhibitori ai angiogenezei, interferon-gamma (IFNγ) și proteina 10 indusă de interferon-gamma (IP-10), au fost identificați ca proteine secretate . S-a demonstrat, de asemenea, că un număr relativ mic de AFSC a fost suficient pentru a secreta o cantitate detectabilă de factori de creștere proangiogenică și citokine. Secreția acestora poate fi reglată într-o manieră dependentă de doză în funcție de numărul inițial al celulelor utilizate .

Un studiu sistematic asupra proteinelor secretate de AFSC a dus la concluzia că factorii solubili proangiogeni din AFSC pot media recrutarea progenitorilor endoteliali într-un model ischemic de șobolan . În special, mediul condiționat derivat din AFSC ar putea furniza local factori de creștere angiogenică și citokine în lambou cutanat al modelului de șobolan ischemic și a fost responsabil pentru declanșarea reparației endogene prin recrutarea celulelor progenitoare endoteliale .

În studiile noastre recente, am examinat potențialul terapeutic al AF-MSC și al moleculelor secretate de acestea la șoarecii cu insuficiență hepatică acută . O varietate de citokine și factori de creștere au fost detectate în mediul condiționat de AF-MSC. Au fost detectate citokine cum ar fi interleukina 10 (IL-10), interleukina 27 (IL-27), familia interleukinei 17 (IL-17E), interleukina 12p70 (IL-12p70), interleukina-1 beta (IL-1β) și antagonistul receptorului interleukinei-1 (IL-1ra), responsabile pentru inducerea reducerii locale și sistemice a mediatorilor pro-inflamatori. De asemenea, au fost secretate SERPINE1, MCP-1 și SDF-1, responsabile de promovarea reparării țesuturilor. În mod interesant, printre factorii de creștere foarte bine exprimați s-au numărat factorul de creștere a celulelor endoteliale derivat din trombocite (PD-ECGF), endostatina/colagenul XVII (EN/Col17), activatorul urinar al plasminogenului (uPA), TIMP1, TIMP2, factorul de creștere asemănător cu EGF care se leagă de heparină (HB-EGF), factorul de creștere a fibroblastelor 7 (FGF7) și factorul de creștere epidermică (EGF), responsabili de regenerarea ficatului și de repararea țesuturilor .

6. Rezumat

Datele actuale de până acum sugerează că lichidul amniotic și membrana amniotică pot reprezenta surse promițătoare pentru celulele stem de origine mezenchimală. Într-adevăr, MSC sunt mai abundente și a fost descrisă o gamă largă de protocoale pentru izolarea lor. Cu toate acestea, s-a raportat că diferitele condiții de cultivare a aceluiași tip de celule pot afecta modelul lor de expresie genetică diferențiată, ceea ce reprezintă o limitare pentru izolarea și extinderea lor in vitro. Studiile care includ analiza fenotipică, utilizând metodologii precum citometria în flux și imunohistochimia, precum și abordări transcriptomice, proteomice și analize secretomice, au ca scop determinarea profilului proteic al acestor celule (figura 1). Se așteaptă ca datele generate de astfel de studii să clarifice repertoriul lor diferențial și să valideze profilul molecular al acestor celule stem. Cu toate acestea, principala problemă care trebuie abordată cu insistență este izolarea unei populații omogene care ar putea facilita studiile sistematice pentru elucidarea funcției acestor celule multipotente.

Figura 1

Rezumat al celor mai importanți markeri identificați în AFCs și AMCs prin utilizarea analizelor transcriptomice, proteomice, secretomice și imunofenotipice. Proteinele identificate în mai mult de un studiu sunt marcate cu bold.

Aceste abordări pot duce la identificarea antigenelor cheie care reflectă fenotipul acestor celule și explică proprietățile caracteristice distincte ale acestora. Acest tip de studii va deschide calea pentru o izolare sistematică și eficientă a acestor celule înainte de utilizarea lor în mediul clinic.

Apendice

Întrebări pentru investigații suplimentare

Care sunt metodele de izolare și condițiile de cultură adecvate ale AFSCs sau AMSCs care vor permite identificarea unui fenotip consistent?

Există un singur marker care poate fi utilizat pentru izolarea AFSC sau AMSC?

Populațiile de AFSC și AMSC sunt eterogene și diferă în ceea ce privește proprietățile lor fenotipice și moleculare. Metodele de izolare pot avea ca rezultat o populație celulară omogenă.

AFSCs sau AMSCs pot fi utilizate ca instrumente în medicina regenerativă: stabilirea condițiilor de cultură cu substanțe de origine animală minime sau fără substanțe de origine animală.

Descoperirea markerilor
Caracterizarea inițială a AFSCs și AMSCs poate fi realizată prin analiza imunofenotipului prin utilizarea unor markeri de suprafață celulară bine caracterizați, cum ar fi AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 și PROM1.

Transcriptomica și proteomica au dezvăluit identificarea markerilor cheie exprimați, cum ar fi
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 și Gal; AMSCs: OGN, βIG-H3 și CD49F.
Din moment ce nu există un marker comun disponibil pentru AFSC și AMSC, trebuie să se utilizeze un panel mai larg de markeri. Acest lucru îndeamnă, de asemenea, la efectuarea de analize suplimentare detaliate de matrice și funcționale pentru a defini cei mai adecvați markeri pentru caracterizarea AFSC și AMSC.

Conflict de interese

Autorii declară că nu au niciun conflict de interese.