Bookshelf

Multe dintre enzimele implicate în biogeneza peptidelor au fost identificate

Cele mai frecvente etape ale procesării precursorilor și enzimele implicate sunt prezentate în figura 18-5. Endoproteazele implicate sunt prohormone convertazele 1 și 2 (PC1 și PC2), exopeptidaza este carboxipeptidaza E (CPE, numită și CPH și enkefalină convertază), iar enzima α-amidantă este peptidilglicina α-amidantă monooxigenaza (PAM). Multe etape din biosinteza lor nu sunt unice pentru neuropeptide, cum ar fi scindarea peptidei semnal, formarea legăturilor disulfidice, adăugarea și modificarea ulterioară a oligozaharidelor legate de N și O, fosforilarea și sulfatarea. După cum este ilustrat în diagrama din figura 18-3, multe dintre etapele posttranslaționale au loc pe măsură ce neuropeptidele în curs de maturizare se deplasează de-a lungul axonului spre sinapsă în LDCV. Etapele ulterioare ale biosintezei neuropeptidelor (Fig. 18-5) sunt unice pentru neuroni și celulele endocrine.

Enzimele cheie în biosinteza neuropeptidelor includ endoproteaze, exoproteaze și enzime care modifică capetele peptidelor. Descoperirea și caracterizarea Kex2p, endoproteza care scindează factorul de împerechere pro-α de drojdie pentru a produce patru copii ale feromonului α-factor de împerechere (Fig. 18-2), au fost esențiale pentru descoperirea convertazelor prohormonale de mamifere, inclusiv furina, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC și PACE4 . Convertazele prohormone convertazelor au o omologie comună cu subtilizinele bacteriene și au o triadă catalitică Asp-His-Ser, care constă în trei aminoacizi cheie implicați în cataliză (notați D, H și S în Fig. 18-5). Proregiunea fiecăruia (Fig. 18-5) trebuie să fie prezentă în timpul biosintezei pentru ca proteaza să se plieze corect, dar trebuie să fie eliminată pentru a obține o protează activată. În cazul PC1 și al furinei, eliminarea proregiunii are loc în câteva minute de la biosinteză, în timp ce enzima se află în reticulul endoplasmatic și este cel mai probabil un eveniment autocatalitic. În cazul celorlalte convertaze de prohormoni, eliminarea proregiunii este mult mai lentă. Exprimarea PC2 activă necesită coexprimarea peptidei 7B2 (Fig. 18-5), care pare să îndeplinească o funcție de chaperon și poate, de asemenea, să împiedice exprimarea activității endoproteolitice a PC2 până când PC2 a fost depozitată în granulele secretorii. Nu a fost identificată nicio peptidă chaperon/inhibitor corespunzătoare pentru celelalte convertaze ale prohormonei.

Endoproteazele mamiferelor cel mai clar implicate în procesarea neuropeptidelor sunt PC1 și PC2, proteaze dependente de Ca2+ care se găsesc în granulele secretorii și a căror expresie este limitată la neuroni și celule endocrine (Fig. 18-5). Câțiva alți membri ai acestei familii de endoproteaze sunt exprimați pe scară mai largă, în timp ce alții sunt exprimați în locații restrânse, distincte de neuroni și celule endocrine. De exemplu, furina se găsește în aproape toate celulele și este localizată în primul rând în rețeaua trans-Golgi; furina catalizează scindări importante în funcția peptidică, cum ar fi scindarea inițială a precursorilor ELH, factorului de creștere nervoasă și hormonului paratiroidian, precum și scindarea în cadrul precursorului receptorului de insulină pentru a produce forma activă αβ dimeră a receptorului. Furina poate fi, de asemenea, instrumentală în activarea unora dintre celelalte enzime de procesare, cum ar fi PC2 și CPE.

PC1 și PC2 clivează la perechi selectate de aminoacizi bazici din precursorii peptidici: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys și Arg-Lys. PC1 poate cataliza, de asemenea, scindări la situsurile Arg unice selectate prezente în unii precursori, cum ar fi prosomatostatina și procolecistochinina. Clivajele în LDCV-uri de către PC sunt strict controlate, având loc adesea într-un mod foarte ordonat (Fig. 18-6). Clivajele inițiale ale POMC au loc în mai puțin de 1 oră (Fig. 18-6, etapele 1 și 2), în timp ce alte clivaje au loc numai după câteva ore (Fig. 18-6, etapele 6 și 7). Clivarea endoproteolitică a propeptidelor este adesea reacția care limitează viteza în procesarea biosintetică a peptidelor.

Programul de clivaje catalizate de PC1, PC2 și furină atunci când sunt exprimate în neuroni și celule endocrine este mult mai selectiv decât modelul de clivaje observat în testele în eprubetă cu enzime purificate. De exemplu, deși convertazele de prohormoni se clivează de obicei la extremitatea COOH-terminală a unei perechi de resturi bazice în substraturile peptidice model, în celule, clivajele pot fi în mijlocul perechilor de resturi bazice, ca în cazul clivajului POMC (Fig. 18-6), unde resturile bazice sunt separate și rămân cu cele două peptide mature rezultate . Este probabil ca concentrația de Ca2+ și pH-ul intern al LDCV să fie două variabile folosite de neuroni și de celulele endocrine pentru a regla activitatea endoproteolitică în LDCV.

Se poate demonstra că alte endoproteaze joacă un rol în biosinteza neuropeptidelor. Principalii candidați sunt omologul mamiferelor al aspartil proteazei-3 din drojdie (YAP-3) și N-arginină dibazică (NRD) de conversie . O întorsătură suplimentară în biosinteza peptidelor este observată în inimă, unde factorul natriuretic proatrial (proANF) este stocat în LDCV și totuși ANF matur este eliberat din celulele atriale în circulație. Prelucrarea proANF, care implică scindarea după un singur reziduu Arg în proANF, nu poate implica PC1 sau PC2, deoarece există cantități neglijabile ale acestor PC în inimă.

CPE este o proteină solubilă care se găsește în aproape toate LDCV-urile din neuroni și celule endocrine (Fig. 18-5) . Ea îndepărtează reziduurile bazice, Lys sau Arg, de la terminațiile COOH ale intermediarilor peptidici produși de convertazele prohormonale. A fost identificată inițial prin distribuția sa tisulară și specificitatea substratului, împreună cu inhibarea sa specifică de către acidul guanidinoetilmercaptosuccinic (GEMSA). CPE este o enzimă activată de Co2+ și Zn2+ cu o proregiune scurtă care este în mod normal îndepărtată în timpul maturării enzimei; spre deosebire de convertazele prohormonale, CPE este activă cu proregiunea atașată. Funcția de carboxipeptidază a procesării peptidelor nu este, în mod normal, limitatoare de viteză, deoarece intermediarii peptidici cu reziduuri bazice COOH-terminale sunt detectați numai la concentrații extrem de scăzute în extractele de țesut sau de LDCV. Recent, au fost identificate alte carboxipeptidaze, în special CPD, o formă membranară integrală a enzimei cu 3 domenii carboxipeptidază. Importanța relativă a CPE și a acestor carboxipeptidaze suplimentare pentru procesarea neuropeptidelor in vivo nu este clară. Având în vedere că scindarea la o pereche de reziduuri bazice poate fi la mijlocul perechii, există motive întemeiate pentru a crede că în LDCV se va găsi o aminopeptidază.

PAM este o enzimă bifuncțională care se găsește în aproape toate LDCV (Fig. 18-5) . PAM acționează asupra substraturilor peptidice după scindarea endoproteolitică și acțiunea exopeptidazei, atunci când este expus un reziduu Gly COOH-terminal, și transformă peptidil-Gly în peptida-NH2 corespunzătoare. Aproximativ jumătate din peptidele bioactive cunoscute sunt α-amidate, iar α-amidarea este, în general, crucială pentru potența biologică. Formele peptidil-Gly și peptide-COOH sunt de obicei inactive la concentrații fiziologice. Prima etapă a reacției de α-amidare este realizată de peptidilglicina α-hidroxilantă mono-oxigenaza (PHM), care este porțiunea NH2-terminală a proteinei bifuncționale PAM. PHM leagă doi atomi de Cu2+ care participă la cataliză prin cicluri de reducere și oxidare. PHM utilizează acidul ascorbic ca reducător, cu un atom de oxigen din O2 încorporat în peptidă în timpul etapei de hidroxilare. Astfel, PHM este foarte asemănătoare din punct de vedere enzimatic cu dopamina β-monooxigenază (DBM), care transformă dopamina în noradrenalină (a se vedea cap. 12). A doua etapă a reacției de α-amidare este realizată de un al doilea domeniu enzimatic al PAM, peptidil-α-hidroxiglicină α-amidantă liază (PAL). Domeniul PAL constituie o enzimă nouă, dependentă de ioni metalici divalenți. Neuronii exprimă în primul rând o formă membranară integrală a proteinei PAM bifuncționale (Fig. 18-5), în timp ce un eveniment suplimentar de îmbinare a ARNm permite unor celule endocrine să exprime versiuni solubile ale proteinei, lipsite de domeniul transmembranar. În formele membranare integrale ale PAM, domeniul scurt COOH-terminal se extinde în citoplasmă și participă la dirijarea PAM între LDCV și suprafața celulară. Rezerva de ascorbat redus în LDCV este menținută de citocromul B561, o proteină care are cinci domenii transmembranare și care transferă electronii de la ascorbatul citosolic la ascorbatul din lumenul LDCV. Citocromul B561 se găsește, de asemenea, în veziculele care conțin catecolamină, unde îndeplinește o funcție similară pentru DBM (a se vedea cap. 12). Țesuturile nervoase și endocrine mențin concentrații de ascorbat redus de aproximativ 100 de ori mai mari decât concentrația de ascorbat din sânge, în timp ce majoritatea celorlalte țesuturi nu concentrează ascorbat.

Câteva peptide au reziduuri de acid piroglutamic NH2-terminal, denumite și acid glutamic ciclic (<Glu), care sunt esențiale pentru bioactivitate, de exemplu, hormonul eliberator de tirotropină (TRH) și hormonul eliberator de gonadotropină (GnRH). Enzima responsabilă pentru această etapă este glutaminilciclaza, care transformă Gln-ul NH2-terminal original în <Glu. Reglarea și funcția glutaminilciclazei nu au fost încă studiate pe larg. O altă modificare importantă, dar puțin frecventă, a peptidelor este α-N-acetilarea (figurile 18-6 și 18-7). În timpul procesării POMC, α-N-acetilarea crește foarte mult puterea de întunecare a pielii a ACTH(1-13)NH2, în timp ce abolește atât puterea steroidogenă suprarenală a ACTH, cât și activitatea opiacee a β-endorfinei . Enzima (enzimele) responsabilă(e) de această modificare nu a (au) fost încă purificată(e) sau clonată(e).

Ca exemplu, figura 18-6 prezintă modelul etapelor de procesare în sistemul POMC . Etapele endoproteolitice inițiale (Fig. 18-6, etapele 1-4) sunt mediate de PC1 și apar în toți neuronii și celulele endocrine producătoare de POMC, de obicei în ordinea numerică prezentată. Este clar că etapele 1 și 2 sunt inițiate în rețeaua trans-Golgi și continuă în LDCV-uri, în timp ce etapa 4 are loc numai în LDCV-uri. Etapele 5-7 au loc numai în LDCV și par să necesite PC2. În hipofiza anterioară adultă, corticotropiile conțin PC1, dar nu PC2, și realizează doar clivajele 1-4. Cu toate acestea, în timpul dezvoltării postnatale timpurii, corticotropele exprimă, de asemenea, PC2 și clivajele 5-7 sunt observate în mod tranzitoriu în corticotrope. La șobolan, expresia PC2 și clivarea în cadrul ACTH (clivarea 5) scad simultan la câteva săptămâni după naștere, aproximativ în momentul în care apare modelul adult de control al ACTH asupra steroidogenezei suprarenale.

Melanotropi și neuronii SNC care produc POMC exprimă atât PC1 cât și PC2 și, astfel, produsele peptidice mai mici sunt observate în aceste celule. PAM este exprimat în toate celulele producătoare de POMC, astfel încât α-amidarea peptidei de îmbinare (JP), o peptidă mică fără o funcție biologică clară, are loc rapid în toate celulele POMC (Fig. 18-6). În melanotropiile hipofizei intermediare și în neuronii POMC din nucleul tractului solitar, are loc α-N-acetilarea ACTH(1-13)NH2 și a β-endorfinei. În melanotropi, α-N-acetilarea ACTH poate avea loc înainte de scindare 5. După cum se indică în figura 18-4, clivajele particulare efectuate și modificările aduse terminațiilor NH2- și COOH-terminale ale produselor peptidice determină amestecul de peptide bioactive eliberate.

.