Biogeneza mitocondrială și hiperactivarea metabolică limitează aplicarea testului MTT în estimarea inhibării creșterii induse de radiații | Scientific Reports

Schimbările în viabilitatea metabolică indusă de radiații nu se corelează cu inhibiția creșterii

În timp ce se studiază inhibiția creșterii induse de radiații în diferite linii celulare folosind testul MTT și numărând numărul de celule, am constatat că rezultatele obținute din testele bazate pe viabilitatea metabolică nu se corelează cu numărul real de celule la diferite momente de timp după expunerea la radiații. Având în vedere că testul MTT este utilizat pe scară largă pe baza faptului că reprezintă cu adevărat numărul de celule viabile din orice eșantion dat2,3,4. Am examinat acest test prin compararea valorilor MTT cu numărul de celule. Celulele cu creștere exponențială au fost expuse la radiații ionizante pentru a analiza inhibarea creșterii, precum și viabilitatea metabolică prin numărarea numărului de celule și, respectiv, reducerea sării de tetrzolium la formazan (testul MTT clasic; utilizat aici ca indice MTT). În primul rând, celulele au fost expuse la diferite doze de radiații ionizante (2, 3, 5 și 7 Gy) pentru a observa modificările dependente de doza de radiații și corelația dintre numărul de celule și viabilitatea metabolică. Cantitatea de formazan formată (adică indicele MTT) la 48 de ore după iradiere în toate cele trei linii celulare (A549, MDA-MB-231 și HeLa) a arătat o reducere de 20 până la 35 % (la 5 Gy și 7 Gy; Fig. Suplimentară 1Ai până la Ci) în comparație cu celulele neiradiate, în timp ce scăderea numărului de celule a fost cuprinsă între 70 și 90 % (Fig. Suplimentară 1Ai până la Ci). 1Aii până la Cii), indicând în mod clar o lipsă de corelație între viabilitatea metabolică (indicele MTT) și inhibarea creșterii (numărul de celule) la toate dozele de iradiere; cei doi parametri de răspuns la iradiere analizați.

În continuare, pentru a examina generalitatea acestei observații, am examinat relația dintre modificările numărului de celule (inhibiția creșterii) și indicele MTT (viabilitatea metabolică) în 7 linii celulare non-tumorogene și tumorogene (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 și MDA-MB-231) la o singură doză (5 Gy), care a indus o inhibiție a creșterii de aproape 50% în cele trei celule testate (Fig. Suplimentară 1). La 24 de ore după iradiere, toate liniile celulare evaluate au prezentat fie egalitate față de control, fie o creștere a valorii indicelui MTT (Fig. 1Ai până la Gi), cu excepția Raw 264.7 (Fig. 1Bi), care este relativ sensibilă la radiații. Pe de altă parte, s-a observat o scădere semnificativă a numărului de celule în aceste condiții (Fig. 1Aii – Gii). La 48 de ore de la iradiere, numărul de celule a fost semnificativ mai mic, variind de la 43% (MDA-MB-231, Fig. 1Gii) la 76% (Raw 264.7, Fig. 1Bii) în comparație cu controlul, în timp ce valorile indicelui MTT au arătat o reducere de doar 10% până la 37%, respectiv, cu un maxim în cazul liniei celulare Raw264.7 (Fig. 1Bi). Atunci când valorile indicelui MTT (Δ OD) au fost normalizate cu numărul corespunzător de celule, acestea au arătat o viabilitate metabolică îmbunătățită de 1,4 până la 3 ori (în diferite linii celulare) pe celulă (informații derivate) la 24 și 48 de ore, care s-a redus în continuare la 48 de ore în majoritatea liniilor celulare, cu excepția celulelor Raw264.7, NIH/3T3 și HeLa, dar rămâne semnificativ mai mare decât controlul respectiv (Fig. 1Aiii-Giii). Aceste observații demonstrează în mod clar că numărul de celule, care este adevărata măsură a inhibiției creșterii și/sau citotoxicității induse de radiații, nu se corelează cu testul de mare randament bazat pe viabilitatea metabolică (MTT), utilizat pe scară largă pentru evaluarea rapidă a răspunsului la radiații, ceea ce pare să se datoreze viabilității metabolice îmbunătățite induse de radiații (Fig. 1Aiii până la Giii) a celulelor expuse.

Expunerea la radiații mărește viabilitatea metabolică prin creșterea masei mitocondriale

Viabilitatea metabolică crescută în celulele expuse la radiații poate rezulta fie din mitocondrii hiperactive, fie din creșterea masei mitocondriale, deoarece conversia MTT în formazan are loc în principal la nivelul mitocondriilor7,8,8,9,10. Se știe că radiațiile ionizante induc masa și funcția mitocondrială în celulele expuse20,21. Prin urmare, am examinat dacă masa mitocondrială crescută este responsabilă de creșterea indicelui MTT în celulele expuse la radiații, utilizând citometria în flux. În conformitate cu observațiile anterioare, am constatat că masa mitocondrială medie pe celulă a crescut semnificativ de aproape 1,4 ori la MCF-7 (minim, Fig. 2Fi) până la 4 ori la Raw 264.7 (maxim, Fig. 2Bi) la 24 și 48 de ore după expunerea la radiații (Fig. 2Ai până la Gi). În același timp, în celulele iradiate s-a observat, de asemenea, o producție sporită de formazan per celulă la momentele respective, cuantificată în condiții experimentale similare (Fig. 2Aii – Gii). Imaginile microscopice la 24 de ore după expunerea la radiații arată, de asemenea, o depunere vizibil îmbunătățită de formazan în celulele iradiate în comparație cu cele de control (Fig. 2Aiii-Giii). Corpurile (mitocondriile) care conțin formazan în celulele de control au o culoare mai puțin intensă, sunt distribuite rar și uniform în citoplasmă, în timp ce în celulele expuse la radiații au avut o culoare închisă și s-au grupat în regiunea perinucleară (Fig. 2Aiii – Giii). Aceste imagini microscopice oferă dovezi vizuale și de susținere a indicelui MTT mai mare sau a viabilității metabolice sporite pe celulă în cazul celulelor iradiate. Mai mult, validează modul în care un număr redus de celule iradiate supraviețuitoare poate produce o cantitate mult mai mare de formazan (densitate de culoare) pe celulă decât celulele de control netratate respective, ceea ce duce la o interpretare falsă a datelor.

Iradierea îmbunătățește viabilitatea metabolică prin inducerea biogenezei mitocondriale

Mitochondria este locul principal unde MTT se reduce la formazan7,8,8,9,10, prin urmare, creșterea masei mitocondriale poate crește viabilitatea metabolică. Creșterea masei mitocondriale în celulele iradiate ar putea fi obținută din două motive în primul rând, radiațiile ionizante induc blocajul G2/M22,23 celulele arestate în faza G2 vor avea un număr mai mare de mitocondrii22,23,24 care pot reduce mai mult MTT la formazan în celulele iradiate. În al doilea rând, se știe că radiațiile ionizante induc biogeneza mitocondrială20,21, ceea ce duce la creșterea masei mitocondriale. Pentru a testa dacă oprirea G2/M indusă de radiații sau biogeneza mitocondrială sau ambele sunt responsabile de creșterea masei mitocondriale per celulă în celulele iradiate, am examinat ambele ipoteze în mod secvențial. Deoarece, masa mitocondrială îmbunătățită indusă de radiații (Fig. 2Ai până la Gi) a fost observată în toate liniile celulare, doar celulele HeLa și MDA-MB-231 au fost selectate aleatoriu pentru a înțelege mecanismele care stau la baza viabilității metabolice îmbunătățite induse de radiații.

Distribuția ciclului celular a fost realizată la 24 și 48 de ore după iradiere. La 24 de ore, au fost găsite 17 și 6% populații de celule în exces în fracția G2/M a ciclului celular în celulele HeLa și, respectiv, MDA-MB-231. Cu toate acestea, blocajul este complet eliminat la 48 de ore (Fig. 3A), ceea ce sugerează că oprirea ciclului celular indusă de radiații poate contribui parțial la creșterea masei mitocondriale la 24 de ore, dar nu și la 48 de ore. De asemenea, este important de remarcat faptul că o creștere de aproape 17% a numărului de celule în faza G2/M nu poate determina o modificare de 1,9 ori (ceea ce reprezintă un procent ridicat de 90%) a masei mitocondriale și o modificare de 1,5 ori a reducerii MTT la formazan la 24 de ore în celulele HeLa (Fig. 2Di și Dii). Deși, blocajul ciclului celular a fost complet eliberat la 48 de ore, totuși masa mitocondrială și viabilitatea metabolică îmbunătățită au rămas semnificativ mai mari decât controalele respective. Aceste observații nu susțin ipoteza că viabilitatea metabolică îmbunătățită indusă de radiații se datorează masei mitocondriale îmbunătățite mediate de oprirea ciclului celular, așa cum s-a raportat anterior în cazul tratamentului cu compuși polifenolici18,25.

În continuare, pentru a testa ipoteza că hiperactivitatea metabolică indusă de radiații, care se corelează cu o masă mitocondrială crescută în celulele expuse (Fig. 2Ai până la Gi), se datorează biogenezei mitocondriale induse de radiații, am analizat numărul de copii ADNmt în celulele de control și în cele expuse la radiații. Numărul de copii al genei Leu t-RNA a fost măsurat pentru numărul de copii de ADNmt codificat de genomul mitocondrial și normalizat cu pol-gamma nucleară, utilizând metoda semi-cantitativă PCR. Atât celulele HeLa, cât și celulele MDA-MB-231 au prezentat o creștere de 18% și 31% a numărului de copii de ADNmt după 24 de ore de expunere la radiații, care crește în continuare până la 138% în cazul celulelor HeLa și rămâne cu 21% mai mare în cazul celulelor MDA-MB-231 decât în cazul celulelor de control la 48 de ore (Fig. 3B). În continuare, am examinat nivelul de expresie în funcție de timp al proteinelor PGC-1α (coactivator 1-alfa al receptorului gamma activat de proliferatori de peroxizomi) și TFAM (factor de transcripție mitocondrial A) utilizând Western blot. Aceste două proteine sunt principalul regulator al biogenezei și menținerii mitocondriale în celule26,27,28. În mod interesant, s-a observat o creștere dependentă de timp atât a expresiei PGC-1α, cât și a TFAM (Fig. 3C) în celulele (HeLa și MDA-MB-231) expuse la radiații, care se corelează cu o masă mitocondrială îmbunătățită la momentul 24 ore (Fig. 2Di și Gi). În continuare, am verificat dacă masa mitocondrială crescută este funcțională și are o expresie crescută a proteinei SDH-A, care este principala enzimă de reducere a MTT în formazan7,8,9,10. S-a constatat, de asemenea, că nivelul proteinei SDH-A a crescut după 8 și 24 de ore de expunere la radiații (Fig. 3C), ceea ce se corelează cu un indice MTT îmbunătățit sau cu o viabilitate metabolică sporită în celulele HeLa și MDA-MB-231 (Figurile 1 și 2). Nivelurile SDH-A au fost găsite semnificativ crescute și în alte linii celulare (datele nu sunt prezentate). În continuare, pentru a valida ipoteza, biogeneza mitocondrială indusă de radiații are ca rezultat o viabilitate metabolică crescută; am inhibat biogeneza mitocondrială cu ajutorul cloramfenicolului29,30. Am constatat că, la o concentrație netoxică, cloramfenicolul a redus semnificativ biogeneza mitocondrială indusă de radiații, în ambele linii celulare (Fig. 3D). atunci când MTT și cinetica de creștere (Fig. 3E și F) au fost efectuate în celulele tratate cu cloramfenicol înainte de expunerea la radiații, aceasta a arătat o formare de formazan semnificativ mai mică decât în cazul radiațiilor singure (Fig. 3E), sugerând astfel că viabilitatea metabolică sporită indusă de radiații se datorează în principal biogenezei mitocondriale. Diferența dintre curba de inhibiție a creșterii indusă de radiații obținută prin testul MTT și numărarea celulelor rămâne de numai 8% în cazul celulelor tratate cu cloramfenicol (Fig. 3E și F), care au fost de 25% și, respectiv, 33% în cazul celulelor HeLa și MDA-MB-231 (Fig. 1Di-ii și Gi-ii). Aceste rezultate susțin ipoteza conform căreia creșterea masei mitocondriale și a viabilității metabolice induse de radiații provine din biogeneza mitocondrială indusă de radiații până la o mare măsură, care este reglată de PGC-1α și TFAM indusă de radiații.

Radiațiile induc hiperactivarea mitocondriilor

În rezultatele anterioare, am observat că radiațiile ionizante induc masa mitocondrială în celule, ceea ce pare a fi responsabil pentru creșterea viabilității metabolice (indicele MTT) în celulele iradiate; cu toate acestea, este cunoscut faptul că radiațiile induc, de asemenea, hiperactivarea mitocondriilor individuale în celulele iradiate31. Pentru a determina dacă indicele MTT îmbunătățit a fost observat doar datorită masei mitocondriale îmbunătățite sau și hiperactivarea mitocondriilor indusă de radiații, am măsurat ΔΨm (potențialul membranei mitocondriale, MMP) prin microscopie cu fluorescență folosind TMRM. Celulele iradiate (la 24 de ore) au prezentat mitocondrii punctate de culoare roșu aprins, ceea ce sugerează un ΔΨm ridicat, în comparație cu controlul (Fig. 4A). Acest rezultat a fost validat în continuare prin estimarea cantitativă a ΔΨm folosind DiOC6 prin citometrie în flux. Celulele HeLa au prezentat o creștere de 2,4 până la 2,8 ori a MMP, cu toate acestea, celulele MDA-MB-231 au prezentat schimbări de 1,3 ori în MMP induse de radiații la ambele momente de timp, respectiv (Fig. 4B). Acest potențial de membrană mitocondrială ridicat se corelează cu formarea de formazan de mai multe ori ridicat în fiecare mitocondrie a celulelor iradiate (imagine inserată în Fig. 2Aiii), sugerând o hiperactivitate a complexului II (SDH) (Fig. 2Aii – Gii), probabil din cauza creșterii ΔΨm induse de radiații. Această observație este în concordanță cu constatările anterioare din alte studii, care sugerează că complexul II este mai eficient în stabilirea și menținerea ΔΨm în condiții de stres32,33. Creșterea ΔΨm datorată hiperactivității complexului II asigură o activitate sporită a altor dehidrogenaze mitocondriale, de asemenea, care pot contribui la creșterea formării de formazan, altele decât SDH.

S-a constatat că oxidarea condusă de succinat prin intermediul complexului II (SDH) are o contribuție semnificativă la generarea sporită de ROS mitocondriale34. Prin urmare, am analizat nivelul de superoxid mitocondrial în celulele de control și cele iradiate pentru a testa faptul că mitocondriile hipermetabolice active ar trebui să producă mai mulți radicali superoxid. Celulele colorate cu MitoSox (indicator ROS mitocondrial) au fost analizate pe citometrul de flux. Celulele iradiate prezintă o fluorescență MitoSox semnificativ mai mare decât controlul respectiv. Ambele linii celulare au prezentat o creștere de aproape 1,25 ori a ROS mitocondriale la 24 de ore, însă aceasta a crescut în continuare la 1,65 ori în cazul celulelor HeLa și la 1,5 ori în cazul celulelor MDA-MB-231 la 48 de ore după expunerea la radiații (Fig. 4C). Deoarece dehidrogenaza mitocondrială SDH este principalul factor care contribuie la reducerea MTT7,8,8,9,10, aceste rezultate validează observația conform căreia creșterea ROS este direct proporțională cu creșterea activității SDH34. Aceste rezultate sugerează că masa mitocondrială sporită constă în mitocondrii hiperactive din punct de vedere funcțional, reducând o cantitate mai mare de MTT în formazan pe celulă în probele iradiate.

Iradierea induce acumularea de calciu în mitocondrii

Iradierea ionizantă perturbă homeostazia celulară a calciului, ceea ce duce la o eliberare sporită de calciu din reticulul endoplasmatic (ER) în citoplasmă, care este apoi tamponată de mitocondriile funcționale din regiunea perinucleară a celulelor35,36. Alterarea homeostaziei calciului induce, de asemenea, producția de ROS (specii reactive de oxigen) și biogeneza mitocondrială35,36,37.

Pentru a investiga dacă viabilitatea metabolică crescută observată la 24 și 48 de ore se datorează nivelurilor crescute de Ca2+ citoplasmatic și mitocondrial, s-a estimat Ca2+ celular și mitocondrial liber. Celulele de control și cele tratate au fost colorate cu Fluo-3AM (indicator de Ca2+) și Rhod-2AM (indicator specific de Ca2+ mitocondrial)38 la momentele respective și au fost analizate pe citometrul de flux. Creșterea semnificativă a nivelului de calciu a fost observată în celulele iradiate, care a crescut de aproape 1,4 ori (40%) în ambele linii celulare (HeLa și MDA-MB-231) investigate, așa cum sugerează fluorescența crescută a Fluo-3 la 8 ore, care se reduce marginal la 24 de ore (Fig. 5A). Interesant este faptul că s-a observat o creștere și mai mare a Ca2+ mitocondrial indusă de radiații (de 2,4 ori la HeLa și de 1,6 ori la MDA-MB-231, Fig. 5B). Această observație a fost verificată în continuare prin vizualizarea celulelor colorate la microscopul cu fluorescență. Au fost observate celulele colorate cu Mitotracker Red, Fluo-3AM și Rhod-2AM în mod independent la 24 de ore după tratamentul cu radiații. Atât Fluo-3AM, cât și Rhod-2AM prezintă o fluorescență puternică punctată perinucleară, cu același model ca și în cazul mitotracker red în celulele corespunzătoare expuse la radiații (Fig. 5C), sugerând că în mitocondrii se acumulează un nivel crescut de Ca2+ citoplasmatic. Mai mult, semnalele specifice de Ca2+ din mitocondrii în celulele colorate cu Rhod-2AM validează această observație. În mod interesant, celulele MDA-MB-231 au prezentat deja un nivel ridicat de Ca2+ mitocondrial (colorare Rhod-2-AM) și o aglomerare mitocondrială perinucleară (colorare Mitotracker Red) în celulele de control, care crește în continuare după iradiere, acesta ar putea fi motivul pentru care această celulă a prezentat cea mai mică creștere a biogenezei mitocondriale induse de radiații și formarea de formazan, ulterior. Am demonstrat în studiul nostru anterior că radiațiile cauzează acumularea de Ca2+ în mitocondrii, ceea ce duce la deteriorarea mitocondriilor și la mitofagie36. Mitocondriile cu un nivel ridicat de Ca2+ și un potențial de membrană mitocondrială îmbunătățit acumulează mai mult A23187 și prezintă o fluorescență mai strălucitoare la microscop la excitarea UV. Cu toate acestea, mitocondriile deteriorate permanent prezintă o fluorescență foarte mare și apar ca niște corpuri rotunde în interiorul celulei36. Pentru a observa acumularea de Ca2+ în mitocondrii în aceste condiții experimentale, am colorat celulele HeLa și MDA-MB-231 de control și iradiate la 24 de ore după expunere (Fig. 5C). Celulele iradiate au prezentat, de asemenea, o acumulare mai mare de corpuri care indică mitocondrii deteriorate induse de radiații. Celulele iradiate prezintă o fluorescență mai mare a Mitotracker Red, Fluo-3AM și Rhod-2AM în regiunea perinucleară (Fig. 5C), unde mitocondria formează o rețea cu reticulul endoplasmatic (ER) și acumulează cea mai mare parte a scurgerilor de Ca2+ induse de stres din ER și protejează celulele de moarte39. Această constatare sugerează că Ca2+ eliberat din depozite după expunerea la radiații este acumulat în principal în mitocondrii. S-a raportat anterior că un nivel ridicat de Ca2+ în matricea mitocondrială sporește activitatea SDH40. Prin urmare, am corelat faptul că Ca2+ acumulat în mitocondrii a crescut activitatea complexului SDH, ceea ce duce la mitocondrii hiperactive și la creșterea viabilității metabolice în celulele expuse la radiații.

Acumularea de calciu în mitocondrii duce la o stare metabolică hiperactivă celulară

În continuare, pentru a fundamenta rolul Ca2+ în formarea sporită de formazan, am testat dacă perturbarea Ca2+ în celule poate crește singură viabilitatea metabolică. Pentru a testa această propunere, celulele au fost tratate cu ionoforul Ca2+ A23187 (2 µM, care crește Ca2+ citoplasmatic, la fel ca radiațiile ionizante) timp de 1 oră și s-a analizat viabilitatea metabolică la 4, 8 și 24 de ore după tratament. În mod interesant, celulele tratate cu A23187 au prezentat o viabilitate metabolică semnificativ crescută (de 1,6 ori) pe celulă la 8 & 24 de ore în cazul HeLa și la 4 & 8 ore în cazul MDA-MB-231 (Fig. 6A), după tratament. Aceste rezultate sugerează că un Ca2+ citoplasmatic sporit crește viabilitatea metabolică, prin creșterea acumulării de Ca2+ în mitocondrii (Fig. 5C). Am verificat, de asemenea, dacă, inhibarea acumulării de Ca2+ în mitocondrii poate împiedica creșterea indusă de radiații a masei mitocondriale. În mod interesant, am constatat că celulele tratate cu un inhibitor al uniportorului mitocondrial de Ca2+, roșu de ruteniu (RuR, care inhibă acumularea de Ca2+ în mitocondrii) au prezentat o creștere semnificativ scăzută a conținutului mitocondrial (indusă de radiații) în comparație cu radiațiile singure (Fig. 6B). Este cunoscut faptul că creșterea Ca2+ induce biogeneza mitocondrială prin intermediul CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, care este, de asemenea, o proteină rezidentă mitocondrială cunoscută pentru reglarea expresiei PGC-1α37,41,42. Prin urmare, concluzionăm, inhibarea acumulării de Ca2+ în mitocondrii folosind roșu de ruteniu a redus masa mitocondrială, probabil prin inhibarea biogenezei mitocondriale. Mai mult, pentru a valida dacă creșterea Ca2+ citoplasmatic indusă de radiații și acumularea acestuia în mitocondrii duce la creșterea viabilității metabolice în celulele iradiate, am tratat celulele cu BAPTA-AM (un chelator de calciu intracelular) și RuR, cu 30 de minute înainte de iradiere. Chelarea Ca2+ citoplasmatic crescut cu ajutorul BAPTA-AM (Fig. 6C) și inhibarea acumulării de Ca2+ în mitocondrii cu ajutorul RuR (Fig. 6D), ambele au abrogat viabilitatea metabolică crescută indusă de radiații după 24 și 48 de ore de iradiere în celulele HeLa și MDA-MB-231 (Fig. 6C și D). Aceste rezultate sugerează că perturbarea homeostaziei Ca2+ indusă de radiații joacă, de asemenea, un rol important în hiperactivarea mitocondriilor și în creșterea viabilității metabolice, probabil în amonte de biogeneza mitocondrială.