Condensatorul – diferite tipuri. Contrastul în microscop
În articolul anterior despre ocular, am subliniat faptul că ocularul era în mod normal amplasat astfel încât planul său focal frontal să fie co-incident cu planul primar de imagine (PIP). PIP este conjugat cu specimenul în setul de planuri conjugate de formare a imaginii și, prin urmare, este util pentru măsurarea caracteristicilor specimenelor microscopice.
În același mod, planul focal frontal al condensatorului este conjugat cu planul focal posterior al obiectivului (dar nu și cu specimenul) în trenul de raze de iluminare. Prin urmare, condensatorul oferă un loc accesibil unde putem modifica sau regla contrastul imaginii prin manipularea razelor de lumină de iluminare. Aceste două principii rezultă din metoda de iluminare a lui Köhler, care a fost tratată în partea a treia a acestei serii.
Funcția condensatorului
Condensatorul îndeplinește două funcții în microscop. El asigură o zonă de lumină iluminată uniform în câmpul vizual la nivelul planului specimenului și iluminează uniform deschiderea obiectivului cu lumină cu un unghi suficient, dar controlabil. În al doilea rând, așa cum s-a menționat mai sus, oferă un mijloc de reglare a contrastului (Bradbury & Evennett, 1996). Cea mai simplă formă de condensator este oglinda concavă, dar aceasta nu este utilă pentru obiective mai mari de NA 0,2 sau cam așa ceva. Dacă microscopul dumneavoastră are o oglindă și o sursă de lumină la distanță, partea plană a oglinzii trebuie să fie utilizată împreună cu orice condensator de substadiu montat. Acest lucru se datorează faptului că, strict vorbind, condensatorul ar trebui să primească o iluminare paralelă și astfel să aducă această lumină la un focar în planul focal posterior al condensatorului (unde se află specimenul).
Tipuri de condensator
Cel mai utilizat tip de condensator este condensatorul Abbe pentru microscopia în câmp luminos (figura 1a, 1b). Acesta este construit din două sau trei lentile, iar lentila superioară cu focalizare scurtă poate fi, de obicei, răsturnată în afara căii optice (1a) sau deșurubată (1b), pentru a umple câmpul vizual cu obiective de putere mică. Acest iluminator simplu va fi suficient pentru majoritatea tipurilor de microscopie. Acesta a fost proiectat inițial pentru a furniza fascicule înguste (sau „creioane”) de lumină oblică de la o deschidere plasată excentric în planul focal frontal al condensatorului. Figura 1c prezintă un iluminator Abbe simplu cu două lentile, montat pe un aparat de substadiu, care poate fi rotit și deplasat excentric pentru a furniza iluminare oblică. Figura 1d prezintă un condensator de mică putere conceput pentru a umple complet câmpul mare de vedere al obiectivelor cu mărire foarte mică.
Deși se poate indica o deschidere numerică pentru condensator (adesea 0,9 NA pentru condensatoare uscate și maximum 1,4 NA pentru tipurile cu imersie în ulei), aceste cifre nu dau nici o indicație asupra NA pentru care razele iluminante sunt corectate pentru aberația sferică. În multe condensatoare simple, un con de lumină solid pentru iluminarea axială este rareori corectat pentru aberația sferică peste 0,45 NA. Pentru lucrări de înaltă calitate ș i pentru rezolvarea structurii la limita rezoluției, condensatoarele trebuie să fie corectate pentru aberații. Condensatoarele complet corectate, ca și obiectivele, conțin multe elemente de lentilă și pot fi corectate aproape în același grad. Condensatorul acromatic-aplanatic (1e) este corectat atât pentru aberația sferică, cât ș i pentru cea cromatică ș i trebuie utilizat pentru lucrări de cea mai bună calitate ș i pentru fotomicrografia color. Condensatoarele aplanatice sunt corectate numai pentru aberația sferică.
Așa-numitele condensatoare „universale” (figura 2) sunt multifuncționale. Ele constau dintr-un disc rotativ care conține o selecție de diafragme de deschidere, filtre, opritori de plasmă, plăci de fază sau prisme Wollaston pentru contrast de interferență diferențială (DIC). Acest aranjament permite trecerea de la o metodă de contrast la alta în mod convenabil și ușor. În general, opritorul de fond întunecat funcționează numai până la NA 0,5 sau aproximativ. Pentru utilizarea cu obiective cu NA mai mare, trebuie să se utilizeze un condensator de fond întunecat special construit (figura 3). Pentru detalii privind utilizarea acestuia și alte metode de îmbunătățire a contrastului, a se vedea Bradbury & Evennett (1996).
Figura 2. Condensatoare universale. Imaginea centrală prezintă capacul superior îndepărtat, afișând discul rotativ în care sunt amplasate anvelopele de fază ale deschiderii, prismele DIC, opritorii de patch-uri de fond întunecat, discurile Rheinberg și filtrele de modulație Hoffman. Majoritatea condensatoarelor universale posedă un iris de deschidere pentru lucrul în câmp luminos, mai multe anule pentru contrastul de fază și un opritor dark-ground pentru dark-ground de mică putere.
Figura 3. Condensatoare dark-ground. 3(a) Condensator dark-ground uscat. 3(b) & & 3(c) Condensatoare dark-ground cu imersie în ulei. 3(d) Condensator de fond întunecat cu imersie în ulei reglabil; acest condensator poate fi reglat pentru a se adapta la diferite grosimi ale lamei, pentru a obține o imagine de fond întunecat de înaltă calitate.
Microscopie cu lumină transmisă și reflectată
Dispoziția microscopului cu lumină transmisă necesită un condensator separat, deoarece lumina este mai întâi condensată pe specimen (unde lumina interacționează cu materia) și apoi este colectată de obiectiv mai departe de-a lungul axei optice.
Situația la microscopul cu lumină reflectată este diferită. Aici, traiectoria razei este pliată în jurul axei specimenului unde lumina este reflectată de pe suprafața acestuia. Obiectivul acționează ca propriul său condensator, iar alinierea microscopului cu lumină reflectată este foarte mult simplificată (a se vedea diagramele de raze din partea 2 a acestei serii). Cu toate acestea, este dificil de accesat planul focal posterior al obiectivului (planul focal anterior atunci când este utilizat ca un condensator), astfel încât se utilizează lentile suplimentare pentru a crea o poziție în care imaginea diafragmelor și a filtrelor să fie conjugată cu planul focal posterior.
Sistemul cu lumină incidentă este foarte util pentru microscopia de fluorescență, în principal pentru că iluminarea specimenului este simplă, este mai eficientă (oferind imagini mai luminoase la măriri mari) și este permisă combinarea cu alte metode de contrast prin lumină transmisă.
Figura 4. Ilustrație a unui epi-iluminator pentru microscopia cu lumină reflectată
Acest epi-condensator are două tipuri de obiective cu lumină reflectată montate în piesa de nas. Obiectivul utilizat este proiectat pentru iluminarea în câmp întunecat, în timp ce celelalte două obiective care pot fi văzute pentru lucrul în câmp luminos cu lumină reflectată. Colierele largi din jurul acestor ultime două obiective permit centrarea obiectivului pe axa optică. „D” de pe carcasa epi-iluminatorului indică inserția interschimbabilă care permite ca unitatea să fie utilizată pentru iluminarea în câmp întunecat. Acesta poate fi înlocuit cu o oglindă plană pentru microscopia cu lumină reflectată în câmp luminos. Condensatorul de lumină transmisă a fost îndepărtat de sub platou.
Dacă obiectivul acționează ca propriul condensator în microscopia cu lumină reflectată, de ce nu sunt folosite obiectivele și pentru iluminare în microscopia cu lumină transmisă? În afară de dificultatea practică de a avea acces la planul focal posterior al obiectivului, este dificil să se dea obiectivelor o utilizare multifuncțională, iar unghiul de iluminare nu este, de obicei, controlabil (printr-o diafragmă iris în planul focal posterior al obiectivului).
Principiile de bază ale îmbunătățirii contrastului
Este necesară o vizibilitate suficientă, sau contrast, pentru ca noi să percepem detaliile din imaginea rezolvată de microscoapele noastre. Selectivitatea este importantă: avem nevoie de cel puțin unele diferențe regionale în interiorul obiectului și între obiect și fundal, pentru a discerne detaliile.
Contrastul în imagine este obținut prin trei mijloace, fie separat, fie în combinație. Acestea sunt:
- interacțiunea specimen-lumină,
- manipularea iluminării și
- manipularea suportului de înregistrare a imaginii.
Alterarea contrastului în partea (c) poate fi realizată prin developare fotografică și/sau imprimare, precum și prin utilizarea contrastului electronic al imaginilor video analogice sau digitale. Cu toate acestea, condensatorul este instrumental în părțile (a) și (b) pentru manipularea contrastului și a vizibilității în imagine. Detalii suplimentare privind aspectele teoretice și practice ale tehnicilor de contrast în microscopia optică pot fi găsite în Bradbury & Evennett, 1996 și Sanderson, 2002, 2000, 1998 și 1994. Pe scurt, cele mai cunoscute forme de generare a contrastului sunt câmpul luminos, iluminarea oblică, dark-ground & Rheinberg, contrastul de fază și DIC. De asemenea, este posibil să se combine aceste metode cu diferite forme de iluminare (de exemplu, lumină polarizată cu Rheinberg sau contrast de fază prin câmp luminos transmis cu fluorescență incidentă). Deoarece îmbunătățirea contrastului se află în mare măsură sub controlul microscopistului, importanța utilizării corespunzătoare a condensatorului nu poate fi subliniată prea mult.
Condensatorul trebuie să fie focalizat corespunzător (a se vedea partea 3, reglarea microscopului pentru iluminarea Köhler) pentru a obține o imagine de cea mai bună calitate. Acest lucru este valabil indiferent de metoda de îmbunătățire a contrastului (câmp luminos, fază, dark-ground). Efectul cel mai evident al unui condensator defocalizat în microscopia în câmp luminos este o pierdere semnificativă a puterii de rezolvare care dă, la rândul său, o imagine „putredă” cu halouri de difracție în jurul fiecărui punct din imagine. Același rezultat apare în cazul în care lentila superioară (cu focalizare scurtă) este omisă sau lăsată răsturnată atunci când se utilizează un obiectiv de mare putere, iar planul focal posterior al obiectivului nu este complet umplut cu lumină.
Când se încearcă microscopia cu contrast de fază cu un condensator nefocalizat greșit, de cele mai multe ori, anvelopa din condensator nu se potrivește cu diametrul inelului de fază din planul focal posterior al obiectivului, iar orice îmbunătățire a contrastului este pierdută. Problemele de focalizare a condensatorului pot duce, de asemenea, la o microscopie slabă pe fond întunecat, în cazul în care imaginea opritorului de plasture nu ocolește complet iluminarea directă din obiectiv. Următoarea parte a acestei serii revine la obiectiv și ia în considerare lungimea tubului și modul de determinare a distanței focale, a măririi, a diafragmei și a altor parametri ai obiectivelor dumneavoastră.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (set de 4 volume) 0-12-164725-0; numai vol 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.
.