Mitochondriale biogenese en metabole hyperactivatie beperken de toepassing van MTT-assay in de schatting van door straling geïnduceerde groeiremming schatting van stralingsgeïnduceerde groeiremming

Verschuivingen in stralingsgeïnduceerde metabole levensvatbaarheid correleren niet met groeiremming

Tijdens het bestuderen van de stralingsgeïnduceerde groeiremming in verschillende cellijnen met behulp van MTT-assay en het tellen van het aantal cellen, ontdekten wij dat de resultaten van op metabole levensvatbaarheid gebaseerde tests niet correleren met het werkelijke aantal cellen op verschillende tijdstippen na blootstelling aan straling. Aangezien de MTT-test op grote schaal wordt gebruikt op basis van het feit dat hij een getrouwe weergave is van het aantal levensvatbare cellen in een gegeven monster2,3,4. Wij hebben deze assay onderzocht door de MTT-waarden te vergelijken met het celgetal. Exponentieel groeiende cellen werden blootgesteld aan ioniserende straling om zowel groeiremming als metabole levensvatbaarheid te analyseren door respectievelijk het aantal cellen en de reductie van het tetrzoliumzout tot formazan (klassieke MTT-test; hier gebruikt als MTT-index) te bepalen. In eerste instantie werden de cellen blootgesteld aan verschillende doses ioniserende straling (2, 3, 5 en 7 Gy) om de stralingsdosisafhankelijke veranderingen en de correlatie tussen het aantal cellen en de metabole levensvatbaarheid te observeren. De hoeveelheid gevormde formazan (d.w.z. MTT-index) bij 48 uur na bestraling in alle drie cellijnen (A549, MDA-MB-231 en HeLa) vertoonde 20 tot 35% vermindering (bij 5 Gy en 7 Gy; Aanvullende Fig. 1Ai tot Ci) in vergelijking met niet bestraalde cellen, terwijl de daling van het aantal cellen in het bereik lag van 70 tot 90% (Aanvullende Fig. 1Aii tot Cii), wat duidelijk wijst op een gebrek aan correlatie tussen metabole levensvatbaarheid (MTT-index) en groeiremming (celaantallen) bij alle bestralingsdoses; de twee geanalyseerde bestralingsresponsparameters.

Verder, om de algemeenheid van deze waarneming te onderzoeken, onderzochten we de relatie tussen veranderingen in celaantallen (groeiremming) en MTT-index (metabole levensvatbaarheid) in 7 niet-tumorogene en tumorogene cellijnen (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 en MDA-MB-231) bij een enkele dosis (5 Gy), die bijna 50% groeiremming in de drie geteste cellen induceerde (Supplementary Fig. 1). 24 uur na bestraling vertoonden alle geëvalueerde cellijnen ofwel gelijkenis met de controle ofwel een stijging van de waarde van de MTT-index (Fig. 1Ai tot Gi), behalve Raw 264.7 (Fig. 1Bi), die relatief stralingsgevoelig is. Anderzijds werd onder deze omstandigheden een aanzienlijke daling van het celaantal vastgesteld (Fig. 1Aii tot Gii). 48 uur na bestraling was het celaantal significant lager, variërend van 43% (MDA-MB-231, fig. 1Gii) tot 76% (Raw 264.7, fig. 1Bii) in vergelijking met de controle, terwijl de MTT-indexwaarden slechts een vermindering van respectievelijk 10% tot 37% te zien gaven, met het maximum in de Raw 264.7-cellijn (fig. 1Bi). Wanneer de waarden van de MTT-index (Δ OD) werden genormaliseerd met het overeenkomstige aantal cellen, toonde het 1,4 tot 3 voudige (in verschillende cellijnen) verhoogde metabole levensvatbaarheid per cel (afgeleide informatie) bij 24 en 48 uur, die verder verminderd bij 48 uur in de meeste van de cellijnen, met uitzondering van Raw264.7, NIH/3T3 en HeLa cellen, maar blijft aanzienlijk hoger dan de respectieve controle (Fig. 1Aiii tot Giii). Deze waarnemingen tonen duidelijk aan dat het celaantal, dat de echte maatstaf is voor de door straling geïnduceerde groeiremming en/of cyto-toxiciteit, niet correleert met de op een hoge doorvoer gebaseerde metabole levensvatbaarheidstest (MTT), die algemeen wordt gebruikt voor de snelle beoordeling van de stralingsrespons, wat te wijten lijkt te zijn aan de door straling geïnduceerde verhoogde metabole levensvatbaarheid (Fig. 1Aiii tot Giii) van de blootgestelde cellen.

Blootstelling aan straling verhoogt de metabole levensvatbaarheid door vergroting van de mitochondriale massa

De verhoogde metabole levensvatbaarheid in aan straling blootgestelde cellen kan het gevolg zijn van hyperactieve mitochondriën of een verhoogde mitochondriale massa, omdat de omzetting van MTT in formazan voornamelijk in mitochondriën plaatsvindt7,8,9,10. Van ioniserende straling is bekend dat het de mitochondriale massa en functie in blootgestelde cellen induceert20,21. Daarom hebben wij met behulp van flowcytometrie onderzocht of een verhoogde mitochondriale massa verantwoordelijk is voor een verhoogde MTT-index in aan straling blootgestelde cellen. In lijn met eerdere waarnemingen vonden we dat de gemiddelde mitochondriale massa per cel aanzienlijk was toegenomen met bijna 1,4 maal in MCF-7 (minimum, Fig. 2Fi) tot 4 maal in Raw 264.7 (maximum, Fig. 2Bi) op 24 en 48 uur na blootstelling aan straling (Fig. 2Ai tot Gi). Gelijktijdig in bestraalde cellen verhoogde productie van formazan per cel ook waargenomen op respectieve tijdstippen, gekwantificeerd onder vergelijkbare experimentele omstandigheden (Fig. 2Aii tot Gii). De microscopische beelden op 24 uur na bestraling tonen ook zichtbaar verhoogde formazan afzetting in bestraalde cellen ten opzichte van hun controle (Fig. 2Aiii tot Giii). De formazan bevattende lichamen (mitochondriën) in controle cellen zijn minder intens van kleur, dun en gelijkmatig verdeeld in het cytoplasma, terwijl in de bestraalde cellen ze donker van kleur waren en geclusterd in de perinucleaire regio (Fig. 2Aiii tot Giii). Deze microscopische foto’s leveren visueel en ondersteunend bewijs voor de hogere MTT index of verhoogde metabole levensvatbaarheid per cel in bestraalde cellen. Verder wordt gevalideerd hoe een kleiner aantal bestraalde overlevende cellen een veel grotere hoeveelheid formazan (kleurdichtheid) per cel kan produceren dan de respectieve onbehandelde controlecellen, wat resulteert in een verkeerde interpretatie van de gegevens.

Bestraling verhoogt de metabole levensvatbaarheid door de mitochondriale biogenese te induceren

Mitochondriën zijn de belangrijkste plaatsen waar MTT wordt gereduceerd tot formazan7,8,9,10, daarom kan een toename van de mitochondriale massa de metabole levensvatbaarheid verhogen. De verhoogde mitochondriale massa in bestraalde cellen kan om twee redenen worden verkregen: ten eerste induceert ioniserende straling G2/M-blokkade22,23 cellen die in de G2-fase zijn gearresteerd, hebben een hoger aantal mitochondriën22,23,24 die meer MTT tot formazan kunnen reduceren in bestraalde cellen. Ten tweede, ioniserende straling is bekend dat mitochondriale biogenese induceren20,21, wat resulteert in een verhoogde mitochondriale massa. Om te testen of straling geïnduceerde G2 / M arrestatie of mitochondriale biogenese of beide zijn verantwoordelijk voor verhoogde mitochondriale massa per cel in bestraalde cellen, onderzochten we beide hypothesen opeenvolgend. Aangezien straling geïnduceerde verhoogde mitochondriale massa (Fig. 2Ai tot Gi) werd waargenomen in alle cellijnen, werden alleen HeLa en MDA-MB-231 cellen willekeurig geselecteerd voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan straling geïnduceerde verhoogde metabole levensvatbaarheid.

De celcyclus verdeling werd uitgevoerd op 24 en 48 uur na bestraling. Op 24 uur werden 17 en 6% overtollige celpopulaties gevonden in de G2/M fractie van de celcyclus in respectievelijk HeLa en MDA-MB-231 cellen. De blokkade is echter volledig opgeheven bij 48 uur (Fig. 3A), wat suggereert dat straling geïnduceerde celcyclus arrestatie gedeeltelijk kan bijdragen aan de verhoogde mitochondriale massa bij 24 uur, maar niet bij 48 uur. Het is ook belangrijk op te merken dat bijna 17% toegenomen aantal cellen in G2/M fase niet kan leiden tot 1,9 maal (dat is 90% hoog) verandering in de mitochondriale massa en 1,5 maal verandering in MTT reductie tot formazan bij 24 uur in HeLa-cellen (Fig. 2Di en Dii). Hoewel de celcyclus blok volledig werd vrijgegeven op 48 uur, toch de mitochondriale massa en verbeterde metabole levensvatbaarheid bleef aanzienlijk hoger dan de respectieve controles. Deze waarnemingen ondersteunen niet de stelling dat straling geïnduceerde verhoogde metabole levensvatbaarheid het gevolg is van celcyclusstilstand gemedieerde verhoogde mitochondriale massa zoals eerder gerapporteerd in het geval van polyfenolische verbindingen behandeling18,25.

Verder, om de hypothese te testen dat straling geïnduceerde hyper metabolische activiteit die correleert met verhoogde mitochondriale massa in blootgestelde cellen (Fig. 2Ai tot Gi) het gevolg is van straling geïnduceerde mitochondriale biogenese, analyseerden we het mtDNA kopiegetal in controle en straling blootgestelde cellen. Het kopiegetal van het Leu t-RNA gen werd gemeten voor mitochondriaal genoom gecodeerd mtDNA kopiegetal en genormaliseerd met nucleair pol-gamma, met behulp van semi-kwantitatieve PCR methode. Zowel HeLa als MDA-MB-231-cellen vertoonden 18% en 31% meer mtDNA-kopiegetal na 24 uur blootstelling aan straling, dat verder toeneemt tot 138% in HeLa en 21% hoger blijft in MDA-MB-231 dan controlecellen na 48 uur (Fig. 3B). Verder onderzochten we het tijdsafhankelijke expressieniveau van PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) en TFAM (Mitochondriale Transcriptie Factor A) eiwitten met behulp van Western blot. Deze twee eiwitten zijn de belangrijkste regulatoren van mitochondriale biogenese en onderhoud in cellen26,27,28. Interessant is dat een tijdsafhankelijke toename van zowel PGC-1α en TFAM expressie (Fig. 3C) werd waargenomen in cellen (HeLa en MDA-MB-231) blootgesteld aan straling, die correleert met een verhoogde mitochondriale massa op 24 uur tijdstip (Fig. 2Di en Gi). Verder controleerden we of de verhoogde mitochondriale massa functioneel is en een verhoogde expressie heeft van het eiwit SDH-A, dat het primaire reductie-enzym is van MTT tot formazan7,8,9,10. De eiwitniveaus van SDH-A bleken ook te zijn verhoogd na 8 en 24 uur blootstelling aan straling (Fig. 3C), wat correleert met een verhoogde MTT index of verhoogde metabole levensvatbaarheid in HeLa en MDA-MB-231 cellen (Figs 1 en 2). SDH-A niveaus werden ook significant verhoogd aangetroffen in andere cellijnen (gegevens niet getoond). Om de hypothese te valideren dat straling geïnduceerde mitochondriale biogenese resulteert in een verhoogde metabole levensvatbaarheid, hebben we de mitochondriale biogenese geremd met chlooramfenicol29,30. We ontdekten dat chlooramfenicol, in een niet-toxische concentratie, de door straling geïnduceerde mitochondriale biogenese aanzienlijk verminderde, in beide cellijnen (Fig. 3D).Toen MTT en groeikinetiek (Fig. 3E en F) werden uitgevoerd in cellen behandeld met chlooramfenicol vóór blootstelling aan straling, toonde het significant lage formazanvorming dan straling alleen (Fig. 3E), waardoor wordt gesuggereerd dat straling geïnduceerde verhoogde metabole levensvatbaarheid voornamelijk te wijten is aan mitochondriale biogenese. Het verschil tussen straling geïnduceerde groeiremming curve verkregen uit MTT-assay en celtellingen blijft slechts 8% in chlooramfenicol behandelde cellen (Fig. 3E en F), die 25% en 33% in HeLa en MDA-MB-231 cellen (Fig. 1Di-ii en Gi-ii), respectievelijk waren. Deze resultaten staven de hypothese dat straling geïnduceerde toename van mitochondriale massa en metabole levensvatbaarheid komt van straling geïnduceerde mitochondriale biogenese tot grote mate, die wordt gereguleerd door straling geïnduceerde PGC-1α en TFAM.

Straling induceert hyperactivering van mitochondriën

In eerdere resultaten hebben we waargenomen dat ioniserende straling de mitochondriale massa in cellen induceert, wat verantwoordelijk lijkt te zijn voor de verhoogde metabole levensvatbaarheid (MTT-index) in bestraalde cellen; het is echter bekend dat straling ook hyperactivering van individuele mitochondriën induceert in bestraalde cellen31. Om te bepalen of verhoogde MTT-index werd waargenomen als gevolg van verhoogde mitochondriale massa alleen of straling geïnduceerde hyperactivering van mitochondriën ook, hebben we gemeten ΔΨm (mitochondriale membraanpotentiaal, MMP) door fluorescentiemicroscopie met TMRM. Bestraalde cellen (na 24 uur) vertoonden helderrode gepuncteerde mitochondriën, wat wijst op een hoge ΔΨm, in vergelijking met de controle (Fig. 4A). Dit resultaat werd verder gevalideerd door een kwantitatieve schatting van ΔΨm met DiOC6 door middel van flowcytometrie. HeLa-cellen vertoonden 2,4 tot 2,8 maal verhoogde MMP, maar MDA-MB-231-cellen toonden 1,3 maal veranderingen in stralingsgeïnduceerde MMP op beide tijdstippen, respectievelijk (Fig. 4B). Deze hoge mitochondriale membraanpotentiaal correleert met een veelvoud aan formazanvorming in elk mitochondrium van bestraalde cellen (inzetfoto in Fig. 2Aiii), wat wijst op een hyper complex II (SDH) activiteit (Fig. 2Aii tot Gii), waarschijnlijk te wijten aan een door straling geïnduceerde verhoogde ΔΨm. Deze waarneming sluit aan bij eerdere bevindingen in andere studies, die suggereren dat Complex II efficiënter is in het tot stand brengen en handhaven van ΔΨm onder stressomstandigheden32,33. De verhoogde ΔΨm als gevolg van hyperactief complex II zorgt ook voor verhoogde activiteit van andere mitochondriale dehydrogenases, die mogelijk bijdragen tot verhoogde formazanvorming anders dan SDH.

Succinaat-gedreven oxidatie via complex-II (SDH) zijn gevonden met de significante bijdrage aan de verhoogde mitochondriale ROS generatie34. Daarom hebben we het mitochondriale superoxideniveau in controle- en bestraalde cellen geanalyseerd om te testen of hypermetabolisch actieve mitochondriën meer superoxide-radicaal zouden moeten produceren. Cellen gekleurd met MitoSox (mitochondriale ROS indicator) werden geanalyseerd op flow cytometer. Bestraalde cellen vertonen een significant sterkere MitoSox-fluorescentie dan hun respectieve controlecellen. Beide cellijnen vertoonden bijna een 1,25-voudige toename van mitochondriale ROS bij 24 uur, maar het nam verder toe tot 1,65-voudig in HeLa en 1,5-voudig in MDA-MB-231 cellen bij 48 uur na blootstelling aan straling (Fig. 4C). Aangezien mitochondriaal dehydrogenase SDH de belangrijkste bijdrage levert aan MTT reductie7,8,9,10, valideren deze resultaten de waarneming van verhoogde ROS is recht evenredig met de verhoogde SDH activiteit34. Deze resultaten suggereren dat de verhoogde mitochondriale massa bestaat uit functioneel hyperactieve mitochondriën, die een grotere hoeveelheid MTT in formazan per cel reduceren in bestraalde monsters.

Straling induceert Calcium accumulatie in mitochondriën

Ioniserende straling verstoort de cellulaire calcium homeostase wat leidt tot verhoogde afgifte van calcium uit het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het cytoplasma, dat vervolgens wordt gebufferd door functionele mitochondriën in het perinucleaire gebied van de cellen35,36. Veranderde calcium homeostase induceert ook ROS (reactieve zuurstofsoorten) productie en mitochondriale biogenese35,36,37.

Om te onderzoeken, of verhoogde metabole levensvatbaarheid waargenomen na 24 en 48 uur is te wijten aan verhoogde cytoplasmatische en mitochondriale Ca2 + niveaus, vrije cellulaire en mitochondriale Ca2 + werd geschat. De controle- en behandelde cellen werden gekleurd met Fluo-3AM (Ca2+ indicator) en Rhod-2AM (specifieke mitochondriale Ca2+ indicator)38 op de respectievelijke tijdstippen en geanalyseerd op de flowcytometer. Een significante verhoging van het calciumgehalte werd waargenomen in bestraalde cellen, dat verhoogd was met bijna 1,4 maal (40%) in beide onderzochte cellijnen (HeLa en MDA-MB-231), zoals gesuggereerd door de verhoogde Fluo-3 fluorescentie na 8 uur, die marginaal vermindert na 24 uur (Fig. 5A). Interessant genoeg werd zelfs meer stralingsgeïnduceerde toename van mitochondriaal Ca2+ (2,4 maal in HeLa en 1,6 maal in MDA-MB-231, Fig. 5B) waargenomen. Deze waarneming werd verder geverifieerd door de gekleurde cellen onder fluorescentiemicroscoop te visualiseren. Cellen gekleurd met Mitotracker Red, Fluo-3AM en Rhod-2AM onafhankelijk van elkaar werden waargenomen 24 uur na bestraling. Fluo-3AM en Rhod-2AM vertonen beide een sterke perinucleaire gepuncteerde fluorescentie met hetzelfde patroon als getoond door mitotracker rood in aan straling blootgestelde overeenkomstige cellen (Fig. 5C), wat suggereert dat verhoogd cytoplasmatisch Ca2+ is geaccumuleerd in mitochondriën. Bovendien valideren specifieke Ca2+ signalen van mitochondriën in Rhod-2AM gekleurde cellen deze waarneming. Interessant is dat MDA-MB-231 cellen al een hoog mitochondriaal Ca2+ (Rhod-2-AM kleuring) en perinucleaire mitochondriale clustering (Mitotracker Red kleuring) vertoonden in controle cellen, die verder toeneemt na bestraling, dit zou de reden kunnen zijn waarom deze cel de laagste toename vertoonde in straling geïnduceerde mitochondriale biogenese en formazan vorming, vervolgens. We hebben aangetoond in onze eerdere studie dat straling accumulatie van Ca 2 + in mitochondriën leidt tot mitochondriale schade en mitofagie36. Mitochondriën met een hoge Ca 2 + en versterkte mitochondriale membraanpotentiaal accumuleren meer A23187 en toont helderder fluorescentie onder microscoop op UV-excitatie. Echter, permanent beschadigde mitochondriën tonen zeer hoge fluorescentie en verschijnen als ronde lichamen in de cel36. Om Ca2+ accumulatie in mitochondriën onder deze experimentele omstandigheden te observeren, kleurden we controle en bestraalde HeLa en MDA-MB-231 cellen 24 uur na blootstelling (Fig. 5C). Bestraalde cellen vertoonden ook een hogere accumulatie van lichaampjes wat wijst op stralingsgeïnduceerde beschadigde mitochondriën. Bestraalde cellen vertonen een hogere Mitotracker Red, Fluo-3AM en Rhod-2AM fluorescentie in de perinucleaire regio (Fig. 5C), waar mitochondriën een netwerk vormen met endoplasmatisch reticulum (ER) en accumuleert het grootste deel van de stress geïnduceerde Ca2 + lekkage van ER en de cellen te beschermen tegen de dood39. Deze bevinding suggereert dat Ca2+ dat vrijkomt uit de opslagplaatsen na blootstelling aan straling, voornamelijk wordt geaccumuleerd in de mitochondriën. Het is eerder gemeld dat hoog Ca2+ in de mitochondriale matrix de SDH activiteit verhoogt40. Daarom correleren we dat Ca2+ opgehoopt in mitochondriën de SDH-complexactiviteit verhoogt, wat leidt tot hyperactieve mitochondriën en verhoogde metabole levensvatbaarheid in aan straling blootgestelde cellen.

Calciumaccumulatie in mitochondriën leidt tot cellulaire hyperactieve metabolische toestand

Verder, om de rol van Ca2 + in verhoogde formazanvorming te onderbouwen, testten we of Ca2 + verstoring in cellen alleen kan de metabole levensvatbaarheid te verhogen. Om deze stelling te testen, werden cellen behandeld met Ca2+ ionofoor A23187 (2 µM, die het cytoplasmatische Ca2+ verhoogt, hetzelfde als ioniserende straling) gedurende 1 uur en werd de metabole levensvatbaarheid geanalyseerd op 4, 8 en 24 uur na de behandeling. Interessant is dat cellen behandeld met A23187 vertoonden een significant verhoogde (1,6 maal) metabole levensvatbaarheid per cel op 8 & 24 uur in HeLa en 4 & 8 uur in MDA-MB-231 (Fig. 6A), na de behandeling. Deze resultaten suggereren dat verhoogde cytoplasmatische Ca2+ de metabole levensvatbaarheid verhoogt, door de accumulatie van Ca2+ in mitochondriën te verhogen (Fig. 5C). We controleerden ook of remming van Ca2+ accumulatie in mitochondriën de stralingsgeïnduceerde toename van de mitochondriale massa kan belemmeren. Interessant genoeg vonden we dat cellen behandeld met inhibitor van de mitochondriale Ca2+ uniporter, Ruthenium Red (RuR, dat de accumulatie van Ca2+ in mitochondriën remt) een significant lage toename van het mitochondriaal gehalte (door straling geïnduceerd) vertoonden in vergelijking met straling alleen (Fig. 6B). Het is bekend dat een verhoogd Ca2+ de mitochondriale biogenese induceert via CaMKII (Calmoduline Kinase-II)37,41, dat ook een mitochondriaal resident eiwit is waarvan bekend is dat het de PGC-1α expressie reguleert37,41,42. Daarom concluderen wij dat remming van Ca2+ accumulatie in mitochondriën met behulp van ruthenium rood de mitochondriale massa verminderde, waarschijnlijk door remming van de mitochondriale biogenese. Verder, om te valideren of straling geïnduceerde verhoogde cytoplasmatische Ca2+ en de accumulatie ervan in de mitochondriën leidt tot verhoogde metabole levensvatbaarheid in bestraalde cellen, behandelden we de cellen met BAPTA-AM (een intracellulaire calcium chelator) en RuR, 30 minuten voor bestraling. De chelatie van het verhoogde cytoplasmatische Ca2+ met BAPTA-AM (Fig. 6C) en de remming van de accumulatie van Ca2+ in mitochondriën met RuR (Fig. 6D), verhinderden beide de stralingsgeïnduceerde verhoogde metabole levensvatbaarheid na 24 en 48 uur bestraling in HeLa en MDA-MB-231 cellen (Fig. 6C en D). Deze resultaten suggereren dat stralingsgeïnduceerde verstoring van de Ca2+ homeostase ook een belangrijke rol speelt in hyperactivering van mitochondriën en verhoogde metabole levensvatbaarheid, waarschijnlijk stroomopwaarts naar mitochondriale biogenese.