Valutazione della diversità microbica dei batteri denitrificanti nel reattore batch

BIOPROCESS ENGINEERING

Valutazione della diversità microbica dei batteri denitrificanti nel reattore batch

S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

Le comunità microbiche in un impianto industriale a fanghi attivi possono contribuire al processo di denitrificazione, ma le informazioni sui microorganismi presenti nei reattori denitrificanti sono ancora scarse. La rimozione dei composti azotati inorganici può essere realizzata tramite l’aggiunta di fonti di carbonio al processo biologico di denitrificazione. L’etanolo è un’alternativa economicamente valida come fonte di carbonio in paesi tropicali come il Brasile, con una produzione su larga scala dalla canna da zucchero. Questo articolo riporta il successo dell’applicazione di fanghi attivi con nitrato ed etanolo in un reattore anaerobico batch. L’operazione è durata 61,5 ore con consumo totale di nitrato in 42,5 ore, generazione di nitriti (2,0 mg/L) e consumo di etanolo (830,0 mg/L) in 23,5 ore. La conta delle cellule denitrificanti secondo il numero più probabile all’inizio dell’operazione era più bassa che alla fine, confermando la capacità dell’inoculo dai fanghi attivi per il processo di denitrificazione. I campioni dalla conta delle cellule sono stati identificati come Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. e batteri non coltivati. Pertanto, queste specie possono essere coinvolte nella riduzione dei nitrati e nel consumo di etanolo nel reattore batch.

Parole chiave: Sistema di fanghi attivi; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrato; Etanolo.

INTRODUZIONE

I microrganismi capaci di denitrificazione sono ampiamente distribuiti in natura: suolo, sedimenti, acqua dolce, mare e sistemi di trattamento delle acque reflue (Park & Yoo, 2009).

Molti inoculi provenienti da impianti di trattamento delle acque reflue domestiche e industriali possono contenere batteri denitrificanti, soprattutto nei sistemi a fanghi attivi (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), dove la rimozione biologica dell’azoto avviene per promuovere la denitrificazione, cioè, in condizioni anossiche eterotrofe, le fonti di carbonio organico agiscono come donatori di elettroni e riducono il nitrato a gas azoto (Canto et al., 2008). La presenza di carbonio organico e di fonti di energia è necessaria per la denitrificazione eterotrofa (Nava et al., 2010).

La maggior parte dei batteri denitrificanti sono compresi nel Phylum dei Proteobatteri, compresi Acidovorax, Comamonas e Acinetobacter, tra gli altri. Tali batteri possono essere presenti nel trattamento dei rifiuti, specialmente nei sistemi a fanghi attivi, che sono in grado di formare azoto molecolare dal nitrato e da una fonte di carbonio esogena, come l’etanolo. La denitrificazione completa, cioè la trasformazione del nitrato in azoto gassoso, è mediata da specie batteriche che normalmente usano l’ossigeno dell’aria come fonte di energia (respirazione aerobica), ma hanno anche la capacità di usare nitrato e nitrito al posto dell’ossigeno (condizione anossica). Così, questi batteri possono crescere aerobicamente in assenza di nitrato, o in condizioni anossiche in presenza di nitrato. La conversione del nitrato in azoto molecolare è nota anche come respirazione anossica (Park & Yoo, 2009).

È stata utilizzata un’ampia varietà di composti organici, come metanolo, etanolo, glucosio, acetato, aspartato o acido formico e composti aromatici (Queiroz et al., 2011). Tuttavia, la maggior parte delle ricerche pubblicate sulla denitrificazione dell’acqua potabile coinvolge l’uso di metanolo, etanolo e acido acetico (Park & Yoo, 2009). L’etanolo (Daniel et al., 2009), il glucosio e l’acetato sono alcuni dei donatori di elettroni esterni utilizzati con successo per la denitrificazione. In particolare in Brasile, l’etanolo rappresenta un’alternativa fattibile (Gavazza dos Santos et al., 2004). L’etanolo è prodotto su larga scala in Brasile dal 1975, con il Programma Nazionale per l’Alcool (19751985). Il Brasile produce quasi 2,6 x 108 tonnellate di canna da zucchero, che viene lavorata da 324 zuccherifici per produrre zucchero ed etanolo (Borrero et al., 2003). È abbondantemente prodotto dalla canna da zucchero e di solito costa meno di altre fonti di carbonio convenienti. Tuttavia, la necessità di ulteriori fonti di donatori di elettroni per il processo esogeno aumenta i costi operativi, rappresentando forse uno svantaggio per l’uso di tecnologie innovative basate sul processo anaerobico (Gavazza dos Santos et al., 2004).

Le relazioni stechiometriche che descrivono la reazione energetica batterica (Park & Yoo, 2009) è scritto come segue, quando l’etanolo viene utilizzato come fonte di carbonio:

0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O

Anche se questa equazione rivela la quantità stechiometrica di etanolo necessaria per la dissimilazione dei nitrati, è necessario ulteriore etanolo per la disossigenazione e la sintesi cellulare. In pratica, dal 25% al 30% dell’etanolo richiesto è utilizzato per la sintesi delle cellule batteriche. Quando l’ossigeno disciolto è presente, il fabbisogno di etanolo è corrispondentemente più alto. Pertanto, un valore di lavoro comune del rapporto in peso tra substrato e nitrato (C:N03) è quasi 3 (Park & Yoo, 2009).

Ci sono solo pochi riferimenti sui reattori batch e sul processo di denitrificazione. Queste configurazioni possono essere utilizzate per studiare i requisiti nutrizionali (Maintinguer et al., 2008). Il processo di denitrificazione con carboidrati complessi viene valutato in reattori batch perché il particolato organico presente in questi sistemi può rendere difficile il funzionamento in altre configurazioni, come con l’amido (Iamamoto, 2006). Inoltre, la biomassa rimane trattenuta nel reattore batch in tutti i periodi di funzionamento rispetto ai reattori a flusso continuo. Questi fatti possono contribuire al consumo totale di nitrato verificato nel reattore batch (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).

La rimozione dei nitrati con inoculo di fanghi attivi è stata studiata soprattutto nei paesi a clima temperato. Ci sono pochi rapporti di studi sulla rimozione dei nitrati e la biologia molecolare con inoculo di fanghi attivi da paesi tropicali come il Brasile. In questo senso, il primo obiettivo del nostro studio è stato quello di valutare il processo di denitrificazione con fanghi attivi come inoculo da climi tropicali. Il secondo obiettivo del nostro studio è stato quello di effettuare una caratterizzazione microbica dell’inoculo per identificare i potenziali organismi specificamente coinvolti nel processo di denitrificazione.

Questo lavoro ha studiato la diversità microbica della denitrificazione in un reattore batch alimentato con etanolo e nitrato utilizzando tecniche di biologia molecolare e metodologia tradizionale di microbiologia.

MATERIALE E METODI

Reattore batch

L’esperimento è stato condotto con fanghi provenienti dal sistema di fanghi attivi dell’impianto di trattamento delle acque reflue della Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brasile).

I reattori batch sono stati preparati in triplicato in palloni Duran® da 2 L, dove 1 L era il mezzo di reazione, 10% (v/v) di inoculo (100 mL/L).

I reattori sono stati sottoposti a un’atmosfera di N2 (99,99%) per 20 minuti dopo la distribuzione delle soluzioni. Dopodiché, sono stati tappati con tappi di gomma butilica, avvolti e mantenuti a 25 ºC ± 1 ºC, con agitazione a 120 rpm operata durante 61,5 h.

Analisi fisico-chimica e cromatografica

I solidi volatili totali (TVS) e il consumo di nitrati sono stati determinati secondo APHA, 2005, spettrofotometricamente. L’analisi dei nitriti è stata eseguita mediante iniezione a flusso (FIA APHA, 2005). Gli acidi grassi volatili e gli alcoli sono stati determinati mediante gascromatografia in un GC-2010 Shimadzu, dotato di un rivelatore a ionizzazione di fiamma, autocampionatore per spazio di testa COMBI-PAL – AOC modello 5000 e colonna HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm di spessore del film), secondo Maintinguer et al, 2008).

Quantificazione dei batteri denitrificanti

Il numero più probabile (MPN) di batteri denitrificanti è stato eseguito a cinque volte la diluizione all’inizio e alla fine del funzionamento del reattore batch, secondo Tiedje (1982), adattato per campioni liquidi. La conta delle cellule con il metodo MPN è stata fatta dopo 15 giorni di incubazione, secondo APHA, 2005. La composizione del mezzo di coltura e le concentrazioni di nitrato ed etanolo utilizzate nei saggi MPN erano simili a quelle del funzionamento del reattore batch, come menzionato in precedenza.

Biologia molecolare

I campioni per l’analisi del 16S rRNA sono stati ottenuti dai più alti conteggi di diluizione positiva (MPN) dei batteri denitrificanti alla fine del test dai reattori batch.

Il DNA genomico totale dei campioni è stato acquisito dopo la lisi cellulare con microsfere di vetro (Sigma) e l’estrazione fenolo-cloroformio come precedentemente descritto da Griffiths et al. (2000) modificato.

L’amplificazione mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata eseguita con un set di primer del dominio batterico per il gene 16S rRNA, 27 forward (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) e 1100 reverse (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). L’amplificazione PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22.331) è stata effettuata con denaturazione iniziale a 94 ºC per 5 min seguita da 30 cicli di denaturazione a 94 ºC per 45 s, annealing a 55 ºC per 45 s, estensione a 72 ºC per 1,45 min ed estensione finale a 72 ºC per 7 min e raffreddamento a 4 ºC.

I campioni di prodotti PCR (Polymerase Chain Reaction) (16S rRNA) sono stati clonati nel vettore plasmidico pGEM (Promega Easy Vector System I) secondo le specifiche del produttore. I cloni sono stati selezionati a caso e amplificati mediante PCR. Il sequenziamento nucleotidico è stato eseguito su un sequenziatore automatico ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) secondo le istruzioni del produttore utilizzando un primer forward M13 (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). L’amplificazione PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) è stata eseguita con denaturazione iniziale a 94 ºC per 2 min seguita da 25 cicli di denaturazione a 94 ºC per 1 min, annealing a 55 ºC per 1 min, estensione a 72 ºC per 1 min; ed estensione finale a 72 ºC per 7 min e raffreddamento a 4 ºC.

Le sequenze nucleotidiche sono state elaborate e sono state allineate con il programma Seqman (pacchetto Lasergene DNAstar) per rimuovere i segnali dal vettore e le basi di bassa qualità. Le sequenze allineate sono state determinate dal programma di ricerca BLAST sul sito web NCBI rispetto alle sequenze degli organismi del gene 16S rRNA rappresentati nel database Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). L’albero filogenetico è stato costruito con il metodo Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) utilizzando il programma MEGA versione 4.1 (Kumar et al., 2008). L’analisi di ricampionamento Bootstrap per 1000 repliche è stata eseguita per stimare la fiducia delle topologie degli alberi. Le sequenze note di Aspergillus niger (FJ828924.1) sono state aggiunte e sono state utilizzate come out-group.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Il nitrato è stato completamente consumato dopo 42,5 h di funzionamento (Figura 1). La generazione di nitriti è stata ridotta (2,0 mg/L a 18,5 h) e si è verificata entro 23,5 ore di funzionamento. 1,06 g di etanolo/L (consumo del 36%) è stato osservato dopo 13,5 h di funzionamento per una concentrazione iniziale di 1.650 mg/L. Il consumo di etanolo alla fine dell’esperimento era del 54% (0,77 g/L in 61,5 h). Questi risultati erano quasi quelli di Gusmão et al. (2006). Gli autori (op.cit.) hanno osservato il 98,9% di consumo di nitrato in 14 h di funzionamento, con cellule purificate di fango granulare da una coperta di fanghi anaerobici a flusso ascendente (UASB) che trattano le acque reflue di un macello di pollame (DAKAR-Tietê SP Brasile), con nitrato (350 N-NO3 mg/L), etanolo (377 mg/L) e benzene (10 mg/L) come fonti di carbonio.

Il metanolo (197,78 mg/L) e il n-butanolo (23,50 mg/L) sono stati rilevati all’inizio della sperimentazione. Questi alcoli (metanolo e n-butanolo) erano probabilmente presenti nell’inoculo. La concentrazione degli alcoli ha mostrato poche variazioni fino alla fine del test, indicando che non sono stati consumati in questa condizione di denitrificazione (Figura 2).

La generazione massima di acido acetico era di 16,7 mg/L a 61,5 ore di funzionamento. I valori di STV all’inizio e alla fine del funzionamento del reattore batch erano 5,14 g/L e 11,40 g/L, rispettivamente, indicando un aumento del 122% della biomassa. Questi risultati hanno dimostrato che le condizioni operative imposte al reattore batch hanno favorito lo sviluppo e la permanenza del consorzio batterico in condizioni di denitrificazione.

In questo studio è stato osservato il processo di denitrificazione, come è stato descritto anche da altri autori utilizzando diverse configurazioni per i reattori.

Callado & Foresti (2001) ha fatto funzionare reattori anaerobici alimentati con substrato sintetico che simula le acque reflue domestiche per rimuovere la maggior frazione di materia carbonica e per promuovere la nitrificazione del substrato, la denitrificazione e la rimozione biologica dei fosfati nello stesso ciclo batch, in un reattore batch sequenziale anaerobico/aerobico/anaerobico. Il sistema è stato fatto funzionare per 41 giorni con 84 cicli di 12 ore, alla temperatura di 28±1 ºC. Gli autori (op. cit.) hanno osservato che la denitrificazione è avvenuta in condizioni aerobiche e anossiche alternate nella fase di reazione. Entrambi i processi si sono verificati solo quando l’acetato di sodio (500 mg/L) è stato aggiunto all’inizio della fase anossica.

Etchebehere et al. (2001), hanno testato l’acetato (40 mmol/L) e il glucosio (13 mmol/L) come fonti di carbonio per la denitrificazione in un reattore batch anaerobico con nitrato di potassio (20mmol/L) per tre diversi inoculi: fango da un reattore anossico (scala di laboratorio) per rimuovere carbonio e azoto dal percolato di una discarica sanitaria; fango da un reattore metanigeno UASB che tratta il malto e fango da un reattore anossico alimentato con acetato e nitrato. Il nitrato è stato completamente consumato dai tre campioni di fango testati, come osservato nel presente studio. Gli autori (op. cit.) hanno concluso che l’acetato è una fonte di carbonio migliore del glucosio.

Gavazza dos Santos et al. (2004) hanno studiato il processo di denitrificazione effettuato in reattori batch alimentati con acque reflue sintetiche che simulano gli effluenti nitrificati degli impianti di trattamento delle acque reflue domestiche utilizzando tre fonti di donatori di elettroni: metanolo (53,3 mg/L), etanolo (38,3 mg/L) e metano (oltre alle acque reflue sintetiche). Gli autori (op.cit.) hanno osservato che il donatore di elettroni più efficace era l’etanolo, che rimuoveva completamente nitriti e nitrati, come osservato in questo lavoro.

Iamamoto (2006) ha ottenuto una rimozione dell’azoto superiore all’84% in un reattore batch sequenziale alimentato con amido e ammonio alternando condizioni anossiche e aerobiche (cicli 2h/2h) e 2 mg O2/L per le seguenti concentrazioni: 125 mg N-NH4/L e 0,95 g di amido/L, 250 mg N-NH4/L e 1,9 g di amido/L, 500 mg N-NH4/L e 3.8 g di amido/L, con inoculo da un sistema di fanghi attivi di una stazione di trattamento delle acque reflue (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasile). Anche l’etanolo (1.500 mg/L) è stato testato come fonte di carbonio insieme a 500 mg di NH4-N/L. Gli autori (op.cit.) hanno osservato che la rimozione di nitriti e nitrati era completa (100%), come osservato nel presente studio, dimostrando la fattibilità dell’uso di etanolo nel processo di denitrificazione.

I conteggi delle cellule denitrificanti in MPN all’inizio del funzionamento del reattore batch erano inferiori (1,1 x 1010 MPN/mL) rispetto alla fine del funzionamento (1,2 x 1019 MPN/mL) (Figura 3). Questi risultati sono superiori a quelli riportati in letteratura, descritti di seguito.

Etchebehere et al. (2001) hanno enumerato le cellule denitrificanti secondo il numero più probabile (MPN) in un terreno di base integrato con estratto di lievito (0,5 g/L), acetato di potassio (1,84 g/ L) e nitrato di potassio (0,72 g/ L) e hanno ottenuto 9,6 x 106 MPN/mL con fango proveniente dal reattore anossico di un sistema di trattamento del percolato. Callado e Foresti (2001) hanno usato l’acetato di sodio come fonte di carbonio in un reattore batch sequenziale anaerobico/ aerobico/anaerobico e hanno trovato più batteri denitrificanti MPN all’inizio dell’operazione (2,5 x 106 MPN/mL) che alla fine (3,5 x 105 MPN/mL). Gli autori (op.cit.) hanno concluso che questa diminuzione non ha influenzato il processo di denitrificazione.

Iamamoto (2006) ha ottenuto lo stesso ordine di grandezza nel MPN dei batteri denitrificanti alla fine del funzionamento di un reattore batch sequenziale con 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) e 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), entrambi con aggiunta di amido (1.900 mg/L) come fonte di carbonio e inoculo da fanghi attivi di un impianto di trattamento delle acque reflue (Rio Claro SP – Brasile).

I batteri denitrificanti erano favoriti dalla condizione nutrizionale imposta nel reattore anossico. Questo fatto ha confermato la capacità dell’inoculo da fanghi attivi per il processo di denitrificazione.

Cinquanta cloni sono stati ottenuti dal campione analizzato per la clonazione e il sequenziamento dei frammenti del gene 16S rRNA del consorzio microbico. Tuttavia, i cloni con valori inferiori a 180 nucleotidi non sono stati incorporati nell’analisi filogenetica perché non erano sufficienti per essere confrontati con il database descritto di seguito. Le sequenze di clonazione e sequenziamento sono state ottenute dal campione positivo alla massima diluizione MPN (10-18) (Tabella 1).

Acinetobacter sp. è stato identificato con le somiglianze di: 98% (cloni 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 e 2, 4, 18, 20, 23 e 27) e 99% (cloni 6, 15, 16, 37 e 38). È un batterio Gram-negativo, non-motile, ossidasi-negativo, non fermentativo, in coppia e appartiene al Phylum dei Proteobatteri, Famiglia delle Moraxellaceae. È un microrganismo importante nel suolo, dove può contribuire alla mineralizzazione, per esempio, dei composti aromatici (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) hanno isolato ceppi di Acinetobacter in un campione da un sistema di fanghi attivi (Jizhuangzi Tianjin – Cina). Questo ceppo era in grado di biodegradare il fenolo (1,1 g/L) tramite cellule libere e immobilizzate. Geng et al. (2006) hanno isolato i batteri che degradano il fenolo in un campione da un sistema di trattamento di fanghi attivi (Singapore). I test biochimici hanno mostrato che questi microrganismi possono crescere in presenza di etanolo, glucosio, saccarosio e composti aromatici come toluene, fenolo e benzoato. È stato descritto come una nuova specie, Acinetobacter EDP3. Gli autori (op.cit.) hanno concluso che questa specie può essere utilizzata per rimuovere i composti fenolici o per il biorisanamento in situ del fenolo nei suoli. Cai et al. (2009) hanno identificato 58 batteri resistenti dal suolo contaminato da arsenico. I ceppi Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas e Stenotrophomonas sono stati identificati in alte concentrazioni (20 mM Ar/L). Gli Acinetobacter sp. identificati in questo lavoro hanno avuto la loro crescita a causa delle condizioni operative imposte e potrebbero contribuire alla denitrificazione.

I cloni 24 e 26 erano simili a Comamonas sp. con somiglianze del 98% e 97%, rispettivamente. I Comamonas sono batteri Gram-negativi appartenenti al Phylum dei Proteobatteri, Famiglia Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) hanno isolato batteri denitrificanti Gram-negativi da un reattore anossico utilizzato per il trattamento del percolato di discarica a Montevideo (Uruguay). La specie isolata aveva somiglianza con Comamonas terrigena. Tuttavia, questo microrganismo è stato considerato una nuova specie, chiamata Comamonas nitrativorans. È stato descritto come un batterio gram-negativo, flagello polare mobile, aerobico e chemioorganotrofo. Questa specie cresceva in etanolo, acetato e butirrato, nitrato, nitrito e può ridurre il nitrato a N2.

Quindi, le specie Comamonas identificate in questo studio erano presenti nell’inoculo dei fanghi attivi e potevano contribuire alla denitrificazione che si verificava nei test.

I cloni 25, 28, 34, 36, 42 e 65 erano simili a Acidovorax sp. con somiglianze del 99% e 97%, rispettivamente (Tabella 1). Acidovorax sp. appartiene al Phylum dei Proteobatteri; si trova facilmente nei sistemi di fanghi attivi. Molte specie di Acidovorax agiscono come microrganismi regolatori dei processi di trattamento microbiologico nei sistemi a fanghi attivi. Diverse specie di Acidovorax sono utilizzate nella biodegradazione della plastica e nella rimozione di altri contaminanti organici, compresi nitrofenoli, nitrobenzene e bifenili policlorurati attraverso la denitrificazione (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) hanno isolato specie di batteri denitrificanti che degradano PHBV (poli-3-idrossi-butirrato-co-3-idrossivalerato) da tre sistemi di fanghi attivi, utilizzati per il trattamento delle acque reflue comunali (Nagoya, Osaka, e Toyohashi – Giappone). I 37 cloni analizzati hanno mostrato somiglianza con organismi appartenenti alla classe Betaproteobatteri. La maggior parte dei cloni ha mostrato somiglianza con la specie Acidovorax, confermando che questa specie era coinvolta nella degradazione del PHBV in condizioni denitrificanti. Gentile et al. (2007) hanno isolato specie simili ad Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium e Achromobacter da un reattore denitrificante funzionante con etanolo (40,0 g/L) e acido lattico (40,0 g/L) come fonti di carbonio; hanno testato i donatori di elettroni separatamente e il nitrato (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) è stato usato come fonte di azoto. Gli autori (op. cit.) hanno concluso che la riduzione completa del nitrato a N2 è stata fatta dalle specie Acidovorax, mentre Achromobacter sp. e Delftia acidovorans erano responsabili della denitrificazione incompleta del nitrato a nitrito. Pertanto, le specie Acidovorax erano presenti nei campioni analizzati in questo studio e potrebbero essere coinvolte nella denitrificazione avvenuta nel reattore batch.

I ceppi batterici non coltivati della famiglia delle Rhodocyclaceae sono stati identificati con il 98% di similarità (clone 9 – AY945917.1 e cloni 46, 84 AY945905), come mostrato nella tabella 1. I membri della famiglia Rhodocyclaceae sono batteri Gram-negativi appartenenti alla classe dei Betaproteobatteri. Sono bastoncini aerobici denitrificanti con capacità metabolica versatile. La maggior parte delle specie vive in habitat acquatici e in condizioni di suolo oligotrofico. Molti di loro sono presenti nelle acque reflue e giocano un ruolo importante nel trattamento biologico di decontaminazione di tali siti (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006), hanno alimentato un reattore denitrificante con chinolina (40 mg/L) un’ammina tossica usata nella produzione di coloranti, pesticidi e combustibili sintetici, glucosio (180 mg/L), nitrato e fosfato di potassio (C/N/P di 150:30:1). L’inoculo proveniva dalla seconda vasca di sedimentazione del sistema di trattamento delle acque reflue dell’industria Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Giappone). La rimozione della chinolina è stata del 90,2% dopo un periodo di reattore stabile (6 settimane). Le analisi biologiche molecolari dell’inoculo e del reattore denitrificante hanno rivelato batteri non coltivati, Thauera e Azoarcus in entrambi i test. Secondo gli autori, le percentuali di cloni affiliati a batteri appartenenti a Azoarcus e Thauera erano rispettivamente il 74% nel reattore denitrificante e il 4% nell’inoculo. La conoscenza dei microrganismi da campioni ambientali dipende dalle condizioni di laboratorio con colture pure (Pace, 1997). Tuttavia, meno dell’1% dei batteri di diversi ecosistemi sono noti (Amann, 1995), o circa il 99% non è stato studiato e identificato. Pertanto, in questo lavoro ci aspettavamo di ottenere sequenze simili di batteri incolti.

L’albero filogenetico ottenuto con primers di consenso del dominio Bacteria nelle analisi di biologia molecolare dell’esperimento è illustrato nella Figura 4.

I coefficienti di similarità tra i diversi gruppi di microrganismi erano dal 97% al 99% e indicavano la presenza di specie filogeneticamente correlate, sulla base delle sequenze di valutazione parziale del gene 16S rRNA. Le sequenze note delle specie provenivano dal database NCBI con Aspergillus niger (FJ828924.1) come sequenza out-group di.

Quindi, le specie Acidovorax, Comamonas e Acinetobacter identificate in questo studio erano presenti nel sistema di fanghi attivi della Volkswagen São Carlos Motors e potrebbero essere coinvolte nella riduzione dei nitrati e nel consumo di etanolo.

CONCLUSIONI

Il potenziale dell’inoculo di un sistema di fanghi attivi e l’uso di etanolo come fonte di carbonio in un processo di denitrificazione sono stati dimostrati in un reattore batch.

I valori di batteri denitrificanti MPN ottenuti in questo studio, combinati con i risultati per la rimozione dei nitrati, hanno rivelato la presenza di batteri denitrificanti nell’inoculo di un sistema di fanghi attivi, favoriti dalle condizioni nutrizionali imposte.

I cloni identificati avevano affiliazione filogenetica nel phylum Proteobacteria, classe Alphaproteobacteria e Gamaproteobacteria, con Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. e batteri non coltivati. Questi batteri potrebbero essere coinvolti nella riduzione dei nitrati e nel consumo di etanolo nel reattore batch anossico.

Si ringraziano gli autori per le sovvenzioni ricevute dal FAPESP e dal CNPq.

APHA, AWWA e WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22a edizione, American Public Health Association, Washington, DC (2005).

Iamamoto, C. Y., Rimozione dell’azoto nel reattore batch in sequenza con biomassa sospesa che tratta le acque reflue ad alta concentrazione di ammoniaca. Tesi di dottorato, Università di San Paolo, Brasile, Scuola di Ingegneria, Università di São Carlos, Brasile (2006).

Messing, J., Nuovi vettori M13 per il clonaggio. Metodi in Enzimologia, 101 20-78 (1983).

Pace, N. R., Una visione molecolare della diversità microbica e della biosfera. Scienza, 276, 734-740 (1997).