Selezione immunologica della difenidramina (Benadryl®) nelle urine e nel sangue Utilizzando un saggio recentemente sviluppato

Abstract

La difenidramina (DPH) è un comune antistaminico da banco che produce sonnolenza e ha il potenziale di causare la guida sotto l’effetto di droghe-incidenti legati all’uso di droghe. Ad oggi non ci sono kit di screening immunoassay disponibili in commercio per la sua rilevazione nei fluidi biologici come l’urina e/o il sangue. Descriviamo un test di immunosorbimento enzimatico (ELISA) di recente sviluppo e riferiamo sulla sua utilità nell’analisi di campioni autentici prelevati da volontari. Il test è specifico per la rilevazione di DPH e non rileva gli antistaminici strettamente correlati come bromfeniramina, clorfeniramina e doxilamina. C’è una quantità variabile di reattività incrociata osservata con alcuni composti triciclici, a causa di somiglianze nella struttura della catena laterale con il DPH. La precisione intra- e intergiornaliera del test è stata determinata per essere inferiore al 10%. Il test è altamente sensibile e ha un range di lavoro da 1 a 500 ng/mL per le urine e da 1 a 250 ng/mL per il sangue. Il test è stato ulteriormente convalidato con campioni autentici di urina e sangue ottenuti da volontari e laboratori del coroner.

Introduzione

La difenidramina (DPH), 2-difenilmetossi-N,N-dimetiletanamina, è un antistaminico a base di etanolamina. È stato uno dei primi agenti antistaminici scoperti nel 1946 ed è ampiamente preso per il sollievo dai comuni sintomi di allergia. DPH esercita la sua azione bloccando gli effetti dell’istamina nei siti dei recettori H1 ed è anche un inibitore del CYP2D6 e un depressore del sistema nervoso centrale (CNS). Oltre ad essere un antistaminico, è anche usato come antiemetico, antitussivo e sedativo. Sebbene sia efficace, il DPH ha diversi effetti collaterali che includono sonnolenza, compromissione motoria, battito cardiaco rapido, visione offuscata e altri (1, 2), quindi è stato segnalato come un fattore di rischio in situazioni di guida pericolosa (3-5). Le interazioni del DPH con altri farmaci e/o alcool, potrebbero aumentare ulteriormente il rischio di incidenti legati alla guida e di incidenti mortali.

Gli antistaminici sono ampiamente classificati in antistaminici di prima generazione, di seconda generazione e da prescrizione. Gli antistaminici di prima generazione, che includono il DPH (Benadryl™), sono tutti disponibili al banco e causano una marcata sonnolenza. Gli antistaminici correlati in questa classe sono la clorfeniramina (Singlet™), la brofeniramina (Dimetapp™), e la doxilamina (Vicks NyQuil™). Un altro antistaminico di prima generazione è il sale 8-clorotiofillinato di DPH, noto come dimenidrinato (Dramamine™), che viene prescritto per la cinetosi. Gli antistaminici di seconda generazione includono loratadina (Claritin™), desloratadina (Clarinex™), acrivastina (Semprex-D™), ebastina (Kestine™), cetirizina (Zyrtec™) e fexofenadina (Allegra™), che sono alternative al DPH che non danno sonnolenza. La figura 1 mostra le strutture chimiche degli antistaminici più comuni.

Gli effetti sonniferi del DPH hanno portato alla sua combinazione con altri farmaci come l’acetaminofene, in formulazioni come il Tylenol PM™, o con decongestionanti nasali come la pseudoefedrina. Anche se il DPH è uno degli antistaminici più vecchi, è facilmente disponibile al banco ed è più efficace e ad azione rapida di alcuni dei più recenti farmaci da prescrizione, da cui il suo uso diffuso (6). L’etichetta di avvertimento sul Benadryl indica chiaramente il pericolo di guidare dopo aver preso il farmaco. Inoltre, numerosi studi hanno chiaramente dimostrato la compromissione delle capacità motorie e delle prestazioni cognitive associate al complesso compito di guidare automobili dopo l’assunzione di DPH rispetto a un antistaminico di seconda generazione o anche all’alcol (7-12). C’è stato anche uno studio sull’aumento del rischio di lesioni dopo l’assunzione di DPH rispetto agli antistaminici di seconda generazione (13). Questi studi razionalizzerebbero chiaramente l’importanza di testare principalmente il DPH.

DPH è disponibile in diverse forme di dosaggio, tra cui liquido, compresse, capsule, gomme da masticare e creme topiche. Il dosaggio suggerito per gli adulti è nell’intervallo di 25-50 mg ogni 4-6 ore, per non superare i 50-100 mg (1). Quando DPH è preso, è rapidamente assorbito dal corpo, con attività massima vista circa 1 ora dopo l’assunzione del farmaco. L’emivita di DPH è di circa 2-9 ore, con concentrazioni plasmatiche di picco raggiunte dopo circa 1-4 ore dall’assunzione della dose. A seguito di una singola dose orale di 50 mg, sono state rilevate concentrazioni plasmatiche medie di picco di 83 ng/mL di difenidramina dopo 3 h, che poi sono diminuite a 9 ng/mL entro 24 h (14). Una singola dose orale di 100 mg di DPH ha portato a concentrazioni plasmatiche medie di picco di 112 ng/mL a 2 ore dopo la dose (15). L’efficacia degli antistaminici si osserva a concentrazioni superiori a 25 ng/mL, la sonnolenza può essere osservata a 30-40 ng/mL, e il deterioramento mentale osservato con concentrazioni superiori a 60 ng/mL (16). È stato riportato che i livelli terapeutici di DPH nel sangue sono compresi tra 25 e 112 ng/mL, i livelli tossici sono circa 5000 ng/mL, e i livelli letali sono ovunque in eccesso di 8000 ng/mL (3, 17). Ci sono stati anche diversi casi di abuso di DPH che sono stati documentati nel corso di molti anni (18-20).

Il metabolismo in vivo di DPH risulta in circa il 30% della dose viene convertito al metabolita N-desmetile, seguito dalla formazione del metabolita N,N-didesmetile e il 13% della dose convertito in metaboliti acetilici attraverso l’ammina. Una piccola percentuale viene convertita in acido difenilmetossiacetico, e la restante percentuale maggiore della dose viene escreta invariata come farmaco madre (21, 22). Il metabolismo della difenidramina è descritto nella figura 2.

I metodi tradizionali di analisi per il DPH nel plasma umano hanno comportato un’estrazione del campione costosa e lunga seguita da procedure di conferma. Diversi gruppi hanno riportato l’uso di vari metodi gascromatografici (GC) per il rilevamento di DPH nel plasma e nelle urine (23-27). Ci sono stati anche rapporti sull’elettroforesi capillare (28) e sui metodi di cromatografia liquida-spettrometrica di massa (LC-MS) (29) che sono stati sviluppati per il rilevamento di DPH. Finora, non ci sono stati rapporti in letteratura sullo screening per la difenidramina utilizzando ELISA o qualsiasi altro metodo immunoassay. In questa pubblicazione, riportiamo il primo metodo di screening ELISA per DPH nell’urina umana e nel sangue.

È considerata una pratica standard nei laboratori di tossicologia eseguire uno screening immunologico, in cui i campioni positivi sono prima identificati e ulteriormente confermati da tecniche GC-MS o LC-MS. Questo è impiegato come una strategia “costo-beneficio” dalla maggior parte dei laboratori di tossicologia, in contrasto con l’esecuzione di una procedura di conferma più costosa su ogni campione ricevuto. Quindi, sarebbe utile un metodo di screening ELISA affidabile da applicare ai campioni DPH relativi agli incidenti di guida e ai decessi. Verso questo obiettivo, i tossicologi hanno presentato raccomandazioni per DUID, tra cui un cutoff DPH proposto di 25 ng/mL nel sangue e 50 ng/mL nelle urine (30). Questo articolo descrive un metodo di screening ELISA robusto e accurato per il DPH nelle urine umane e nel sangue seguendo queste linee guida proposte.

Sperimentale

Materiali

Reagenti e prodotti chimici. La difenidramina è stata ottenuta da Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), e la difenidramina-d3 (soluzione 100 μg/mL in metanolo) è stata ottenuta da Cerilliant (Round Rock, TX). L’anticorpo policlonale specifico DPH è stato sollevato da Immunalysis (Pomona, CA), e gli apteni DPH e i coniugati marcati con perossidasi di rafano sono stati sintetizzati da Immunalysis. Il reagente substrato 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) utilizzato per la reazione colorimetrica è stato ottenuto da Pierce (Rockford, IL). Gli enzimi utilizzati nel processo erano tireoglobulina bovina (BTG) ottenuta da Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), perossidasi di rafano (HRP) ottenuta da BBI Enzymes (Madison, WI), e sieroalbumina bovina (BSA) ottenuta da Proliant Biologicals (Boone, IA). Tutti i solventi utilizzati erano di grado HPLC, e tutti i prodotti chimici erano di grado ACS e ottenuti da Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Per l’ELISA, gli alti calibratori per il DPH a 1000 ng/mL sono stati preparati in urina sintetica negativa e sangue sintetico negativo e conservati a 4°C. L’urina sintetica negativa e il sangue sintetico negativo utilizzati in questo test sono stati formulati con ingredienti presenti in queste rispettive matrici e corrispondono alle risposte immunologiche di tre campioni umani negativi di urina e sangue (31, 32). L’urina sintetica negativa consiste in una soluzione di BSA allo 0,1% in acqua deionizzata; con lo 0,2% di colorante FD&C giallo #6, e il sangue sintetico negativo consiste in una formulazione proprietaria Immunalysis.

Apparato. HiTrap proteina G HP colonne di affinità che sono stati utilizzati per la purificazione di immunoglobulina G (IgG) sono stati acquistati da GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Piastre di polistirene standard per microtitolazione (96 pozzetti) sono state ottenute da Corning Costar (Corning, NY). Un Tecan Columbus Pro microtiter piastra lavatrice e Tecan Sunrise piastra lettore sono stati entrambi ottenuti da Tecan (San Jose, CA). Le pipette che sono state utilizzate durante il processo di sviluppo dell’immunodosaggio sono state tutte ottenute dalla Rainin Instruments (Oakland, CA). Un MS 6410 a triplo quadrupolo e la colonna Zorbax Eclipse XDB C18 utilizzata per l’analisi LC-MS-MS sono stati entrambi acquistati da Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Metodi

ELISA. Il passo principale nello sviluppo del metodo ELISA ha coinvolto la generazione di anticorpi policlonali che erano basati sulla risposta immunochimica di una specie animale selezionata ad un antigene specifico DPH. Verso questo obiettivo, i conigli sono stati prima immunizzati con un antigene DPH costituito da DPH coniugato con tireoglobulina bovina (BTG). Il processo di immunizzazione e sanguinamento dei conigli è stato appaltato a una struttura specializzata in animali. Il siero ottenuto dai conigli è stato purificato in-house mediante cromatografia di affinità con eluizione attraverso colonne di proteina G, al fine di ottenere la frazione IgG purificata. Le IgG policlonali specifiche per DPH sono state poi immobilizzate su piastre di polistirene a 96 pozzetti. L’anticorpo in eccesso è stato aspirato, i siti di legame dell’anticorpo libero bloccati con una soluzione di trealosio all’1% in acqua e le piastre sono state poi asciugate in un forno a vuoto a 37°C per una notte. Le piastre sono state ulteriormente conservate in una busta sigillata con essiccante, poiché è fondamentale mantenerle prive di umidità. Una curva dose-risposta delle urine DPH è stata preparata fortificando le urine sintetiche negative a 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 e 500 ng/mL dalla soluzione stock del calibratore alto del farmaco. La curva del sangue è stata ottenuta fortificando il sangue sintetico negativo a 1, 5, 10, 25, 50, 100 e 250 ng/mL dalla soluzione di calibratore alto. Questi calibratori nel sangue sintetico sono stati poi ulteriormente diluiti 1:10 con 100 mM di tampone fosfato contenente 150 mM di cloruro di sodio (tampone fosfato salino, pH 7.0) prima dell’analisi. Tutti i campioni di sangue sono stati analogamente diluiti 1:10 con soluzione salina tamponata al fosfato (pH 7,0). Anche i campioni di urina sono stati diluiti 1:20 con una soluzione salina tampone fosfato 100 mM (pH 7.0). I calibratori e i campioni sono stati poi pipettati in duplicato nei pozzetti della piastra di microtitolazione, utilizzando una dimensione del campione di 10 μl sia per le urine che per il sangue. Questo è stato seguito dall’aggiunta di 100 μL di coniugato enzimatico costituito da difenidramina marcata con HRP. La piastra è stata poi lasciata incubare per 1 ora al buio, a temperatura ambiente. I pozzetti sono stati poi lavati sei volte con 350 μL di acqua deionizzata utilizzando una rondella per micropiastre, aspirati per rimuovere l’acqua, poi capovolti e asciugati per rimuovere ogni residuo di acqua dai pozzetti. Il substrato cromogenico TMB (100 μL) è stato poi aggiunto ad ogni pozzetto e la piastra è stata incubata per altri 30 minuti al buio. La reazione è stata poi fermata con 100 μL di acido cloridrico 1 N, per produrre un colore giallo. Il test è colorimetrico e l’assorbanza è stata letta a una doppia lunghezza d’onda di 450 nm e 650 nm utilizzando un lettore di piastre per microtitolazione. La lunghezza d’onda di 650 nm misura l’assorbanza di fondo, che il lettore di piastre sottrae dall’assorbanza finale. L’intensità del colore prodotto è inversamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione.

LC-MS-MS. Per l’analisi è stata utilizzata una pompa LC della serie 1200 accoppiata a un MS a triplo quadrupolo 6410 operante in modalità di ionizzazione elettrospray positiva (ESI). La colonna LC-MS-MS utilizzata era una Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Il campione da analizzare è stato preparato come segue: un campione di urina da 100 µL contenente 50 µL di difenidramina-d3 (200 ng/mL) è stato aggiunto a una fiala dell’autocampionatore. I campioni sono stati iniettati direttamente nella LC-MS-MS tramite un autoiniettore. La temperatura della colonna è stata mantenuta a 60°C e il volume di iniezione era di 5 µL. La fase mobile consisteva in acido acetico 0,2% pH 4 (solvente A) e metanolo (solvente B). Inizialmente, la composizione della fase mobile era 100% A ad una velocità di flusso di 0,7 mL/min per un periodo di 6 min, poi la percentuale di metanolo è stata aumentata al 100%, quindi è tornata nuovamente al 100% A dopo 7 min.

La temperatura del gas era di 350°C, il flusso di gas era di 10 L/min e la pressione del nebulizzatore è stata mantenuta a 50 psi. L’azoto è stato usato come gas di collisione e la tensione capillare era di 4000V. Due transizioni sono state selezionate e ottimizzate per ogni farmaco. Il tempo di permanenza era di 50 ms, e l’energia ottimale del frammentatore era di 80V per tutte le transizioni. Le tensioni ottimali di energia di collisione sono state determinate per essere 35V per lo standard interno deuterato (difenidramina-d3), 15V per la transizione primaria e 30V per la transizione secondaria per la difenidramina stessa. Il rapporto tra la transizione del qualificatore e la transizione del quantificatore è stato determinato approssimativamente al punto medio dell’intervallo di calibrazione: 100 ng/mL. La transizione per difenidramina-d3 era 259,7 > 165,2; transizione primaria (quantificante) per difenidramina era 256,7 > 167,2; transizione qualificante (secondaria) 256,7 > 152,2. La difenidramina non etichettata può scomporsi in ioni prodotto di m/z 167 o 165 dallo ione precursore a seconda dell’energia di collisione applicata. La nostra procedura è stata convalidata utilizzando le condizioni descritte. Il limite di rilevazione (LOD) del metodo LC-MS-MS era 10 ng/mL ed è stato determinato per essere la più bassa concentrazione rilevabile con un rapporto segnale/rumore > 2.

Risultati e discussione

Curva dose-risposta

Il metodo utilizza il legame competitivo tra il coniugato enzimatico e l’analita libero nel campione per una quantità fissa di siti di legame anticorpale, proporzionale alla loro concentrazione nella miscela. Le curve dose-risposta per il DPH sono state preparate nelle urine sintetiche negative e nel sangue sintetico negativo alle concentrazioni descritte in precedenza. B0 è l’assorbanza del calibratore negativo e B rappresenta l’assorbanza dei singoli livelli del calibratore. Il rapporto percentuale del calibratore individuale al calibratore negativo (B/B0) è stato calcolato per ogni livello di calibratore e tracciato contro la concentrazione del farmaco (ng/mL) sia per le urine che per il sangue (Figura 3). I valori B/B0 sono inversamente proporzionali alla concentrazione di droga nel campione, la ragione è che maggiore è la concentrazione di droga, meno coniugato farmaco-enzima si lega all’anticorpo, producendo così un valore di assorbanza inferiore.

LOD e cutoff

Il LOD del test DPH è stato determinato come la concentrazione più bassa che può essere misurata accuratamente usando i parametri descritti per il test. Tre campioni di urina autentici senza droga sono stati fortificati con concentrazioni variabili di DPH fino a 1 ng/mL e poi analizzati in duplicato. Il valore più basso calcolato da due deviazioni standard è stato ottenuto e basato su questo risultato il LOD per il test è stato determinato per essere 1 ng/mL. Le concentrazioni di cutoff sono state progettate per essere 50 ng/mL per le urine e 25 ng/mL per il sangue. Entrambi sono stati stabiliti come punti decisionali ottimali basati su due deviazioni standard dei calibratori nella parte lineare della curva dose-risposta, nonché tenendo presente le linee guida raccomandate stabilite dal campo della tossicologia.

Selettività

L’interferenza da composti correlati e non correlati è stata studiata aggiungendo queste sostanze nelle urine sintetiche negative ed eseguendole nel test ELISA. La tabella I mostra i dati di reattività incrociata con i composti strettamente correlati per struttura e attività farmacologica alla difenidramina, che sono risultati pari o inferiori all’1% al cutoff del test di 50 ng/mL. L’orfenadrina, che è un rilassante muscolare e un agente antistaminico, ha reagito in modo incrociato con il test al 42% perché ha una struttura molto simile al DPH, anche se un gruppo sostitutivo metile. Nessuno dei metaboliti di DPH mostrati nella figura 2 sono stati esaminati come cross-reagenti in questo test perché non erano disponibili in commercio al momento.

Composti che non erano correlati a DPH sono stati analizzati anche a concentrazioni di 100.000 ng/mL nel test. La tabella II mostra la reattività incrociata con questi composti non correlati. La maggior parte di questi composti non ha interferito con il rilevamento di DPH nel test. A causa di somiglianze nella struttura della catena laterale, diversi composti come amitriptilina, clorpromazina, clomipramina, doxepin, imipramina e ciclobenzaprina hanno mostrato vari gradi di cross-reattività con il test. I metodi di conferma dovrebbero preferibilmente escludere qualsiasi falso positivo rilevato dall’ELISA come risultato di questi cross-reagenti che potrebbero interferire con il test del DPH. Sono stati anche studiati gli effetti della matrice da campioni di sangue e di urina autentici senza DPH per determinare i loro effetti sul test. Non sono stati osservati risultati falsi positivi indesiderati dovuti alle matrici delle urine e del sangue quando le urine e i campioni di sangue senza DPH confermati dalla LC-MS-MS sono stati analizzati con il test.

Precisione

Le precisioni intraday e interday del test ELISA sono state eseguite solo in urine sintetiche a concentrazioni di 0, 5, 10, 25 e 50 ng/mL. La precisione intraday è stata calcolata come coefficiente di variazione (CV%) da 8 analisi effettuate nello stesso giorno (n = 8) ed è risultata inferiore al 10%, mentre la precisione interday (CV%) calcolata da 8 analisi al giorno per 10 giorni (n = 80) è risultata anch’essa inferiore al 10%. I dati sono riportati nella tabella III.

Stabilità e shelf-life del test

La shelf-life di un prodotto può essere definita come il tempo in cui le caratteristiche essenziali della performance vengono mantenute in specifiche condizioni di manipolazione (33). Al fine di soddisfare questo requisito per i reagenti clinici, è stato eseguito uno studio di test di stabilità accelerato per determinare la durata di conservazione approssimativa del prodotto commerciale. Il coniugato enzimatico DPH-HRP è stato stressato a 37°C per un periodo di 14 giorni e durante questo periodo è stato analizzato a intervalli e le sue prestazioni sono state confrontate con il coniugato farmaco-enzima refrigerato conservato a 4°C. La curva dose-risposta è stata eseguita a livelli di calibrazione di 10, 50 e 100 ng/mL in urina sintetica per un periodo di 14 giorni. Si è riscontrato che il test ha mostrato una risposta alla dose quasi identica per l’intero studio a tempo accelerato di 2 settimane. Questo periodo di 14 giorni di test a tempo accelerato rappresenta l’equivalente di almeno 18 mesi di stabilità in tempo reale a 4°C (33). I dati sono mostrati nella figura 4.

Campioni autentici

Al fine di convalidare il test, sono stati ottenuti campioni di urina in momenti diversi per un periodo di una settimana da cinque volontari che sono utenti terapeutici regolari di difenidramina a causa di sintomi allergici comuni. A tutti e cinque i volontari è stato chiesto di compilare un questionario indicando tutti i farmaci che stavano prendendo, ed è stato notato che non sono stati elencati altri farmaci. Venti campioni sono stati raccolti e prima controllati con ELISA e poi confermati con LC-MS-MS. Tutti i campioni di urina sono stati prediluiti 1:20 con una soluzione salina tampone fosfato 100 mM (pH 7.0) prima di eseguire l’ELISA. Sei campioni sono risultati negativi con entrambi i metodi, mentre 14 campioni sono risultati positivi con l’ELISA, di cui 1 campione è stato confermato come negativo dalla LC-MS-MS. Questo potrebbe essere dovuto al fatto che la quantità di DPH presente in quel campione come trovato da LC-MS-MS era vicino al cutoff di 50 ng/mL. I campioni di urina positivi sono risultati contenere DPH tra i livelli di 60 e 700 ng/mL. Dieci campioni di urina di controllo sono stati anche preparati fortificando l’urina sintetica negativa con basse e alte concentrazioni positive di difenidramina e ulteriormente analizzati nel test. I risultati sono stati tutti positivi tramite ELISA e correlati ai loro dati di conferma LC-MS-MS.

I campioni post mortem sono stati utilizzati per la convalida del test del sangue. Venti campioni di sangue post mortem sono stati ottenuti dal laboratorio del coroner della contea di Los Angeles. Tutti i campioni di sangue sono stati prediluiti 1:10 con una soluzione salina tampone fosfato 100 mM (pH 7.0) prima dell’analisi. Tutti i 20 campioni sono risultati positivi tramite ELISA e sono stati confrontati con i loro dati di conferma GC-MS, anch’essi forniti dal laboratorio del coroner, che hanno mostrato di contenere un’ampia gamma di concentrazioni di DPH tra < 100 e 870 ng/mL. Anche se un campione ha confermato meno del limite di quantificazione GC-MS di 100 ng/mL, DPH è stato ancora identificato utilizzando la procedura ELISA. L’obiettivo di questo studio era quello di convalidare il metodo ELISA con una procedura di conferma nota e non tentare di interpretare le concentrazioni. La conclusione di questo studio è che il test ELISA è in grado di rilevare livelli terapeutici di DPH, così come livelli postmortem molto più alti, e quindi potrebbe essere facilmente utilizzato per scopi di screening DUID, così come casi di fatalità.

Conclusioni

DPH è un farmaco da banco che è stato collegato a numerosi incidenti di guida così come fatalità. Quindi uno screening ELISA sarebbe utile per determinare la presenza di farmaci da banco come gli antistaminici in campioni ottenuti attraverso situazioni di guida. Questo articolo descrive lo sviluppo di un metodo di screening ELISA altamente sensibile e specifico per la difenidramina in entrambe le matrici di urina e sangue con precisione <10%. Al meglio delle conoscenze degli autori, questo è il primo metodo immunoassay sviluppato per la rilevazione di DPH nei fluidi corporei umani. Questo metodo segue le linee guida raccomandate su un cutoff di 50 ng/mL nelle urine e 25 ng/mL nel sangue per i casi DUID. La validità del metodo è stata verificata anche con campioni di urina e sangue autentici, e i dati ELISA sono stati correlati con i risultati di conferma LC-MS-MS e GC-MS. Anche se alcuni dei campioni analizzati provenivano da casi post mortem, i risultati ottenuti da questi, combinati con il basso LOD del test, dimostrano chiaramente l’applicabilità del test ai casi di alterazione della strada, dove potrebbero essere rilevate quantità inferiori di DPH. Si è osservato un certo grado di reattività incrociata con alcuni composti triciclici che sono strutturalmente simili al DPH; tuttavia, qualsiasi falso positivo derivante da tali composti verrebbe eliminato in fase di conferma. Ulteriori studi devono essere condotti per eliminare i problemi di reattività incrociata con i composti triciclici e migliorare quella con antistaminici simili.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di Immunalysis Corporation. Vorremmo ringraziare il Dr. James Soares e il Sig. Michael Vincent per le profonde discussioni durante la preparazione di questo manoscritto, la Sig.ra Cynthia Coulter per l’analisi LC-MS-MS dei campioni di urina, e il Sig. Dan Anderson al laboratorio del coroner della contea di Los Angeles per aver fornito campioni di sangue positivi. Desideriamo anche ringraziare tutti i volontari che hanno fornito campioni di urina.