Saggio della placca

Il saggio della placca può essere usato per purificare una popolazione clonale di virus o per determinare il titolo virale come unità formanti placche per ml (pfu/ml) in modo che quantità note di virus possano essere usate per infettare le cellule durante il lavoro successivo. In questo test, i monostrati di cellule vengono infettati con un basso rapporto di virus, in modo che le cellule sporadiche vengano infettate. Una sovrapposizione di agarosio mantiene le cellule stabili e limita la diffusione del virus. Quando ogni cellula infettata produce il virus e alla fine si liscia, solo le cellule immediatamente adiacenti vengono infettate. Ogni gruppo di cellule infette viene definito una placca. Le cellule non infette circondano le placche. Dopo diversi cicli di infezione, le cellule infette al centro delle placche cominciano a lisi e le cellule infette periferiche rimangono circondate da cellule non infette. Questo fenomeno fa sì che la luce che passa attraverso le cellule infette si rifranga in modo diverso rispetto alle cellule non infette circostanti, e la placca può essere visualizzata sia a occhio nudo che al microscopio ottico. Ogni placca rappresenta un singolo virus. Pertanto, le popolazioni di virus clonali possono essere purificate isolando le singole placche. Le singole placche ottenute da varie diluizioni di uno stock virale possono essere contate per determinare il titolo virale (pfu/ml) di una data trasfezione o stock di virus. La condizione delle cellule e la loro distribuzione uniforme sulla superficie della piastra di coltura di tessuti è importante per il successo di un test delle placche. Le cellule dovrebbero essere sane, > 95% vitale, e in crescita log-fase al momento del test. Le cellule grumose, le cellule che non sono uniformemente distribuite alla densità corretta (>70%) sulla piastra, e le cellule che non aderiscono ai piatti di coltura di tessuti entro 30 minuti dopo la messa in piastra sono dannose per il test.

Materiali aggiuntivi richiesti:

Agarosio per saggio della placca, Cat. No. 554766
Medium per cellule di insetti non integrato di Grace
Serio bovino fetale
Vassoio per colture tissutali, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
Bagno d’acqua 42°C

Protocollo

Determinare il numero di piastre necessarie

Per ogni co-trasfezione o stock di virus (e controllo positivo) fare duplicati di diluizioni seriali (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Etichetta ogni piastra da 60 mm con le descrizioni del campione e della diluizione.

Semina la piastra di coltura con cellule di insetti

1. Semina 2,3 x 10 6 cellule Sf9 su ogni piastra da 60 mm. Scuotere delicatamente le piastre avanti e indietro, poi da un lato all’altro per distribuire uniformemente le cellule sulla superficie della piastra. Non far roteare mai la piastra; questo provoca una distribuzione irregolare delle cellule. Una volta che le piastre sono state seminate, lasciare che le cellule aderiscano per 30 minuti o un’ora. Durante questo tempo, preparare la soluzione di agar e le diluizioni virali. Visualizzare, al microscopio ottico, per confermare il >70% di confluenza e la distribuzione uniforme delle cellule.

Preparare la soluzione di agarosio

Le cellule piastrate sono sovrapposte con una soluzione di agarosio all’1% in Grace’s Insect Cell Medium integrato con 10% FBS.

1. Prima, equilibrare il bagnomaria a 42°C. Determinare il volume totale della soluzione di agar necessaria: moltiplicare 4 ml/piastra per il numero di test della placca. Di questo volume totale, una metà sarà autoclavato dH 2 O + agarosio per fare una soluzione al 2%, e l’altra metà sarà Grace’s Insect Media integrato con 10% FBS. Per determinare la quantità, in grammi, di agarosio per il test delle placche necessaria per fare una soluzione finale di agarosio all’1%, moltiplicare il volume totale per 0,01. (Per esempio, 10 piastre x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Aggiungere la quantità appropriata di dH 2 O autoclavato in una bottiglia di vetro sterile di dimensioni adeguate. Successivamente, aggiungere lentamente la quantità calcolata di agarosio, mentre delicatamente agitare per mescolare il dH 2 O e agarosio. Mettere la miscela al microonde fino a quando non bolle. Rimuovere la bottiglia e controllare la miscela per qualsiasi agarosio non disciolto. Se è presente, continuare il riscaldamento. Ripetere fino a quando l’agarosio è completamente sciolto (ATTENZIONE: la miscela e il vapore che l’accompagna sono molto caldi e possono bruciare. Usare l’attrezzatura di sicurezza/precauzioni appropriate). Una volta che l’agarosio si è completamente sciolto, tappare leggermente la bottiglia e trasferire al bagno d’acqua a 42°C. Lasciare raffreddare la miscela a 42°C.
3. Prendere il Grace’s Insect Media e aggiungere siero bovino fetale al 10%. Esempio: per 100 ml di Grace’s Insect Media, aggiungere 10 ml di FBS. Posizionare il Grace media + 10% FBS mix nel bagno d’acqua 42 ° C.

Preparare diluizioni seriali virali

1. Per ogni co-trasfezione, etichetta sei tubi sterili da 15 ml da 10 -1 a 10 -6 con la descrizione del campione appropriato. Aggiungere 2,7 ml di media TNM-FH a ciascuna provetta. Aggiungere 0,3 ml del surnatante di co-trasfezione al primo tubo, tubo vortex. Eseguire diluizioni seriali trasferendo 0,3 ml alla diluizione successiva, utilizzando una pipetta fresca ogni volta.

Infettare le cellule monostrato

1. A questo punto, le cellule hanno avuto tutto il tempo per aderire alla superficie della piastra. Controllare diverse piastre al microscopio ottico per confermare il 70% di confluenza e la distribuzione uniforme delle cellule.
2. Lavorando con le piastre duplicate di ogni diluizione, aspirare attentamente i media dalle cellule usando una punta di pipetta sterile da 200 µl e il vuoto. Non interrompere il foglio cellulare. Aggiungere 1 ml della diluizione virale appropriata a ciascuna delle piastre duplicate e scuotere delicatamente la piastra avanti e indietro, poi da un lato all’altro per distribuire uniformemente il virus. Ripetere con tutte le piastre e le diluizioni corrispondenti.
3. Far oscillare delicatamente le piastre a temperatura ambiente, in cappa sterile ogni 15 minuti per 1 ora.

Sovrapporre le cellule infettate con agarosio

1. Dopo 1 ora, confermare che la soluzione di agarosio è a 42°C. La soluzione dovrebbe essere abbastanza calda da essere ancora allo stato liquido, ma dovrebbe essere abbastanza fresca da poter essere tenuta in mano. Se non puoi tenere comodamente la bottiglia, la soluzione è troppo calda e ucciderà le cellule Sf9. Confermare che il Grace’s Insect Media w / 10% FBS è a 42 ° C. Se è così, aggiungere un volume uguale alla soluzione di agarosio per completare la soluzione finale di agar. Mescolare bene la soluzione di agar finale.
2. Una volta che la soluzione è pronta, mettere in un bicchiere di vetro riempito con acqua dal bagno d’acqua. Questo dovrebbe evitare che la soluzione si solidifichi mentre la usi sotto la cappa. Durante la procedura, controlla periodicamente la temperatura dell’acqua nel becher. Se sta iniziando a raffreddarsi, sostituirla con acqua calda dal bagno d’acqua.
3. Lavorando con una coppia di duplicati alla volta, aspirare attentamente i media dalle cellule usando un puntale per pipetta sterile da 200 µl e il vuoto. Non interrompere il foglio di cellule. Durante l’aspirazione, inclinare leggermente la piastra e aspirare il surnatante dal bordo della piastra. Questo permetterà un’aspirazione ottimale senza disturbare il foglio cellulare. In seguito, aggiungere lentamente 4 ml di soluzione di agar ad ogni piastra e permettere all’agar di solidificare.
4. Una volta che l’agar su tutte le piastre si è solidificato, posizionare con cura le piastre in una camera di incubazione pulita ed ermetica. Umidificare la camera mettendo una garza sterile e 10 ml di acqua sterile in un piatto di coltura da 10 mm sul ripiano inferiore della camera di incubazione. Sigillare la camera e metterla in un incubatore a 27°C. Lasciare incubare le piastre per 6 – 10 giorni.
5. Le placche possono essere visualizzate capovolgendo le piastre su uno sfondo scuro e illuminandole con una forte fonte di luce dal lato della piastra, o tenendole con un angolo di 45° verso una fonte di luce. Quando impari a identificare una placca, cerchia le possibili placche con un pennarello. Usando il microscopio ottico, visualizza a bassa potenza per confermare che c’è un’area di compensazione nel prato di cellule. Visualizzare ad alta potenza per cercare le cellule infette alla periferia della compensazione, poi meno cellule infette come ci si allontana dalla zona di compensazione.
6. Per facilitare la visualizzazione delle placche, sovrapporre con 3 ml di agarosio 0,5% (preparato come descritto in precedenza) contenente 50 µg/ml rosso neutro. (Preparare rosso neutro (Sigma N7005) soluzione stock a 1 mg/ml in acqua o PBS. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4°C al buio). Lasciare indurire e incubare la piastra per una notte a 27°C. Il rosso neutro colorerà le cellule sane e le placche appariranno come aree chiare, approssimativamente 0,5 – 3 mm di diametro su uno sfondo bianco. Dal momento che il rosso neutro è un colorante vitale, è importante colorare mentre il monostrato di cellule è sano, cioè da 4 a 7 giorni dopo l’infezione.

Purificazione delle placche dallo stock virale

Per garantire un isolamento adeguato, è meglio che le placche siano prelevate da piastre contenenti meno di 50 placche. Piastra diverse diluizioni del virus per garantire un numero sufficientemente basso di placche sono ottenuti. Le placche possono essere prelevate utilizzando punte di micropipette sterili (1.000 µl) o tubi microcapillari.

Amplificare il virus dal prelievo delle placche

1. Marcare la piastra sotto la placca con un marcatore. Usando una punta di pipetta sterile, rimuovere un tappo di agarosio direttamente sopra la placca. Raccogliere tra 10 e 100 placche in questo modo.
2. Porre ogni spina di agarosio in una provetta da microcentrifuga separata contenente 1 ml di terreno di coltura dei tessuti. Eluire le particelle di virus dall’agarosio ruotando la provetta per una notte a 4°C.
3. Aggiungere 200 µl di ogni placca prelevata in pozzetti separati di una piastra di coltura di tessuti a 12 pozzetti con 2 x 10 5 cellule per pozzetto in 1 ml di terreno TNM-FH fresco. Incubare le piastre per 3 giorni a 27°C.
4. Il surnatante virale di questo stock di passaggio-uno può essere raccolto e centrifugato per 5 min a 1.000 x g a 4°C per rimuovere i detriti. Conservare a 4°C.
5. Seminare una piastra di coltura di tessuti da 100 mm con 5 x 10 6 cellule per ogni placca isolata. Lasciare attaccare le cellule e sostituire il terreno con 10 ml di terreno TNM-FH fresco.
6. Aggiungere 200 µl del brodo di passaggio-uno alla piastra da 100 mm e incubare a 27°C per 4 giorni. Conservare i restanti 800 µl di stock di passaggio uno a 4°C come riserva.
7. Raccogliere il surnatante virale e centrifugare per rimuovere i detriti. Determinare il titolo di questo stock di secondo passaggio. Se il titolo rimane inferiore a 2 x 10 8 pfu/ml, procedere all’amplificazione di Baculovirus.