Dopo essersi laureato alla Southwest Texas State University di San Marcos, Texas, Boothe entrò nella compagnia di repertorio dell’Oregon Shakespeare Festival, con ruoli in Enrico IV, parte 2 (ritraendo Enrico IV d’Inghilterra), Troilo e Cressida, e altri. Il suo debutto sul palcoscenico di New York fu nella produzione del 1974 del Lincoln Center di Riccardo III. Cinque anni dopo, il suo debutto teatrale a Broadway avvenne in un ruolo da protagonista nell’atto unico Lone Star, scritto da James McLure.
Boothe arrivò all’attenzione nazionale nel 1980, interpretando Jim Jones nel film della CBS-TV Guyana Tragedy: The Story of Jim Jones. Il ritratto di Boothe del folle leader del culto ricevette il plauso della critica. Nella storia di Time sulla produzione, Boothe fu elogiato: “C’è una performance straordinaria. Un giovane attore di nome Powers Boothe cattura tutto il carisma e il male di ‘papà’, Jim Jones”. Boothe vinse l’Emmy Award per il suo ruolo, battendo i veterani Henry Fonda e Jason Robards. Mentre la Screen Actors Guild era in sciopero nell’autunno del 1980, fu l’unico attore ad attraversare i picchetti per partecipare alle cerimonie, dicendo all’epoca: “Questo potrebbe essere il momento più coraggioso della mia carriera o il più stupido.”
Boothe interpretò Philip Marlowe in una serie televisiva basata sui racconti di Raymond Chandler per la HBO negli anni ’80. È apparso in film come Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire e Extreme Prejudice, così come nei film della HBO Into the Homeland e By Dawn’s Early Light. Inoltre, è apparso nel film della CBS-TV Family of Spies del 1990, in cui ha interpretato l’ufficiale della marina traditore John Walker. Boothe ha interpretato Curly Bill Brocius nel successo del 1993, Tombstone, l’ufficiale superiore sleale dell’esercito in Blue Sky (di fronte all’interpretazione di Jessica Lange che ha vinto l’Oscar), e il sinistro terrorista principale in Sudden Death. Ha anche fatto parte dei grandi cast per Nixon di Oliver Stone (come capo di stato maggiore Alexander Haig) e U Turn (come sceriffo della città).
Nel 2001, ha interpretato Flavius Aëtius, il generale romano incaricato di fermare l’invasione degli Unni nella miniserie televisiva Attila. Boothe ha interpretato il ruolo del proprietario di bordelli Cy Tolliver nella serie della HBO Deadwood, e lo squallido senatore Roark nel film Sin City (2005), e nel suo sequel, Sin City: A Dame to Kill For (2014). È la voce di uno dei personaggi del videogioco Area 51 del 2005 e di Gorilla Grodd, il supercattivo telepatico iperintelligente in Justice League e Justice League Unlimited. Ha doppiato il cattivo, Kane, nel videogioco Turok del 2008.
È stato una special guest star in 24, dove ha interpretato il vicepresidente Noah Daniels. È tornato nel prequel della settima stagione, 24: Redemption. Subito dopo aver assunto il ruolo di presidente ad interim, Boothe è visto uscire dall’Air Force Two con degli F-15 sullo sfondo. Boothe ha interpretato un pilota di F-15 abbattuto in Red Dawn. Nel marzo 2008, ha narrato uno spot televisivo per la campagna presidenziale del senatore John McCain.
Nel 2012, Boothe è apparso in The Avengers di Joss Whedon in un ruolo segreto come un oscuro superiore governativo di S.Nel 2015-16, ha ripreso il ruolo, ora chiamato Gideon Malick, in Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe è apparso nella miniserie del 2012 Hatfields & McCoys come giudice Valentine “Wall” Hatfield. Boothe è stato anche scritturato come Lamar Wyatt nella serie drammatica musicale della ABC Nashville. Boothe ha anche prestato la sua voce a Hitman: Absolution, un videogioco del 2012 sviluppato da IO Interactive, doppiando il personaggio di Benjamin Travis.