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Gli streptococchi sono gli abitanti più abbondanti della bocca umana (6, 24), e hanno frequentemente accesso al flusso sanguigno attraverso lesioni parodontali o abrasioni orali create da attività di routine (32). Questo può portare a gravi malattie, tra cui l’endocardite infettiva (IE) (28) e la batteriemia neutropenica (29). La tassonomia degli streptococchi orali è stata a lungo fonte di confusione (4, 9, 20, 22, 31). Il sequenziamento del gene 16S rRNA ha chiarito immensamente la situazione (13); tuttavia, questo approccio manca della sensibilità necessaria per distinguere alcune specie strettamente correlate, tra cui Streptococcus mitis e Streptococcus oralis (12), o per consentire la tipizzazione dei ceppi o l’analisi filogenetica all’interno delle specie. Sono stati quindi esaminati i geni che possiedono una maggiore variabilità, compreso lo spaziatore intergenico trascritto 16S-23S rRNA (ITS) (2), i geni housekeeping codificanti proteine (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23), o entrambi (17, 18). Non è ancora emerso un consenso sul gene o sui geni più adatti a questi scopi. Inoltre, sebbene studi precedenti abbiano identificato streptococchi orali da emocolture cliniche utilizzando metodi di sequenziamento definitivi (12, 23, 30), nessuno ha riportato informazioni cliniche dettagliate sulla malattia sottostante. Ci siamo proposti di fare entrambe le cose.

Le colture del flusso sanguigno eseguite all’ospedale del Virginia Commonwealth University Medical Center da maggio 2003 a maggio 2008 sono state presuntivamente identificate come contenenti streptococchi dal laboratorio di microbiologia clinica. Uno script informatico è stato utilizzato per escludere le specie nonorali. Per evitare l’analisi dei contaminanti, le piastre di isolamento sono state richieste solo quando due o più rapporti provenivano da colture separate dello stesso paziente. Una colonia da ogni piastra di isolamento disponibile è stata coltivata in brodo ed esaminata macroscopicamente e microscopicamente. Se sono state osservate differenze in colture separate derivate dallo stesso paziente, entrambe le colture sono state conservate. Altrimenti, una singola coltura da ogni paziente è stata crioconservata, e le aliquote sono state rimosse per l’amplificazione PCR.

Per determinare l’identità di specie e la parentela filogenetica di ogni isolato, il 16S-23S ITS è stato amplificato usando i primer 6R e 13BF descritti precedentemente (2). Quando i prodotti non sono stati ottenuti da alcuni isolati, abbiamo notato che i tre nucleotidi finali del primer 6R non si allineavano con le sequenze 23S rRNA in GenBank da diverse specie di interesse. Abbiamo quindi accorciato e semplificato il primer 6R, creando 6R-S, e accorciato il primer 13BF per abbinare la sua temperatura di annealing (vedi tabella S1 nel materiale supplementare). Una modifica simile del primer 6R è stata riportata recentemente (18). Utilizzando questi primer, gli ampliconi PCR sono stati ottenuti da tutti gli isolati e sottoposti ad analisi capillare della sequenza del DNA.

La maggior parte delle sequenze di DNA conteneva l’ITS completo e porzioni dei geni 16S e 23S rRNA, che sono stati allineati con sequenze ITS da ceppi tipo disponibili in GenBank o determinati da noi da ceppi ottenuti dall’American Type Culture Collection (ATCC). Abbiamo trovato che le sequenze 16S e 23S di accompagnamento, anche se non conservate nella maggior parte delle sequenze pubblicate, hanno facilitato l’allineamento ITS. Infatti, sono state pubblicate almeno quattro sequenze di ceppi tipo (18) in cui una CTAAGG situata 78 bp prima dell’estremità 3′ del gene 16S rRNA sembra essere stata confusa con una sequenza esanucleotidica identica definita precedentemente (2) come l’inizio dell’ITS. Le sequenze ITS ritagliate (2) sono state poi confrontate e allineate con il software MEGA 4 (25) per costruire un albero filogenetico neighbor-joining (Fig. 1).

E’ stato suggerito in precedenza che la sola analisi ITS è sufficiente per l’identificazione delle specie di streptococchi orali, compresa quella delle specie strettamente correlate S. mitis e S. oralis. Le delezioni monobase conservate in due siti e una lunghezza totale dell’ITS di 246 bp sono state suggerite come caratteristiche dello S. oralis, mentre lo S. mitis è stato proposto per mancare delle delezioni e possedere un ITS di 248-249 bp (2, 3). Nel nostro studio, abbiamo trovato isolati di entrambe le specie che possedevano entrambe le delezioni o nessuna, insieme a lunghezze ITS sovrapposte. Quindi, gli isolati di S. oralis e S. mitis non potevano essere distinti in modo affidabile con questi criteri. Un altro studio ha suggerito che l’analisi della sequenza ITS, mentre non è sufficiente per distinguere S. oralis e S. mitis, è sufficiente per l’identificazione di molte altre specie di streptococco orale, comprese quelle appartenenti al gruppo anginosus (18). Tuttavia, abbiamo trovato un isolato della specie del gruppo anginosus S. intermedius (VMC38) che non poteva essere classificato da ITS (vedi Tabella S1 nel materiale supplementare).

Un gran numero di isolati, in particolare per S. mitis e Streptococcus constellatus, possedeva anche sequenze identiche, precludendo l’analisi filogenetica. Sequenze identiche sono state ottenute anche da cinque coppie di isolati provenienti dagli stessi pazienti (dati non mostrati).

Poiché l’analisi ITS non era sufficiente per i nostri scopi, abbiamo sequenziato un secondo obiettivo comune, il gene sodA, che codifica per la superossido dismutasi dipendente dal manganese (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Questo ha permesso l’esclusione di diversi isolati. Le coppie di ceppi menzionate sopra, che provenivano dagli stessi soggetti e avevano sequenze ITS identiche, possedevano anche sequenze sodA identiche, confermando che gli isolati erano identici, e un isolato di ogni coppia è stato eliminato. Due isolati sono stati eliminati a causa di un apparente errore nella gestione del ceppo, e un altro non è stato mantenuto perché le sequenze ITS e sodA indicavano che era un ceppo di Enterococcus faecalis. Un albero filogenetico derivato dai rimanenti isolati è mostrato in Fig. 1.

L’allineamento sodA era superiore a quello dell’ITS per l’analisi filogenetica. Gli unici isolati con sequenze sodA identiche erano due ceppi di S. mitis e due ceppi di Streptococcus vestibularis. L’allineamento sodA era anche più utile per la determinazione delle specie. Tutti i ceppi di riferimento erano ben separati gli uni dagli altri nell’albero filogenetico. Il risultato è stato solo quattro assegnazioni di specie ambigue per sodA, rispetto a 15 per l’ITS (vedi tabella S1 nel materiale supplementare). Nei casi in cui una singola designazione di specie era coerente con entrambe le sequenze ITS e sodA, tale designazione è stata utilizzata. Solo 3 dei 58 isolati clinici finali non potevano essere identificati con sicurezza usando questo metodo. Gli isolati VMC1 e VMC43 hanno prodotto sequenze ITS che erano troppo corte per essere informative, nonostante i ripetuti tentativi di sequenziamento, e VMC58 è stato incoerentemente identificato dalle sequenze ITS e sodA (Fig. 1; Tabella S1). Abbiamo confermato l’identità di specie di questi isolati utilizzando un database recentemente pubblicato contenente sequenze di sette geni housekeeping da 420 ceppi streptococcici ben caratterizzati, tra cui sodA, pfl e pyk (1). Le sequenze dei geni pfl e/o pyk di tutti i ceppi discutibili sono state determinate e allineate con le sequenze del database eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), così come le sequenze sodA esistenti. In tutti i casi, le assegnazioni delle specie pfl e pyk erano in accordo con quelle di sodA. Inoltre, l’allineamento sodA ha indicato che la sequenza VMC58, mentre divergeva dal ceppo tipo, rientrava in un cluster di 13 isolati di Streptococcus infantis nel database (dati non mostrati). L’identificazione di consenso della specie di tutti gli isolati inclusi nello studio sono indicati nella Fig. 1 e nelle Tabelle S1 e S2 nel materiale supplementare.

Mentre questi risultati suggeriscono che l’analisi sodA da sola è sufficiente per identificare la maggior parte dei ceppi, raccomandiamo l’inclusione di almeno un gene housekeeping codificante una proteina supplementare per tutti i ceppi. Molti streptococchi orali sono naturalmente competenti e sono stati riportati casi di acquisizione di geni housekeeping stranieri, incluso sodA (1, 12). Questo non era evidente nel nostro studio, ma c’erano casi di sequenze chimeriche ITS (VMC38 e VMC50) e sodA (VMC33). Due pubblicazioni recenti sono andati più lontano, ognuno suggerendo il sequenziamento di un diverso set di sette geni housekeeping per la tipizzazione di sequenza multilocus (7) o analisi di sequenza multilocus (1). Questi approcci si basano sull’analisi di un numero maggiore di geni per fornire una maggiore risoluzione e per minimizzare gli effetti di geni occasionali chimerici o estranei (1, 7). Questi schemi permettono anche analisi filogenetiche più sofisticate che sono possibili con solo due o tre geni. Abbiamo occasionalmente incontrato difficoltà, tuttavia, nell’amplificazione e nel sequenziamento di pfl e pyk e poco successo con due degli altri geni raccomandati, map e ppaC (1). Un altro studio recente ha riportato difficoltà simili (27). Quindi, la scelta dei geni aggiuntivi può richiedere test empirici, ma quelli impiegati nelle analisi a sette geni dovrebbero essere esplorati per primi, poiché sono disponibili grandi collezioni di sequenze da ceppi ben caratterizzati per il confronto (1, 7).

A nostra conoscenza, questa è solo la seconda segnalazione di un isolato da emocoltura di Streptococcus australis (12) o S. infantis (30). L’unica altra associazione di quest’ultima specie con qualsiasi malattia proviene da due rapporti del suo isolamento dall’espettorato di adulti con fibrosi cistica (17, 26). È quindi interessante che un adulto con fibrosi cistica sia stato la fonte del nostro isolato di S. infantis, VMC58 (vedi Tabella S2 nel materiale supplementare).

I dati di suscettibilità antibiotica sono inclusi nella Tabella S2 e sono in gran parte in accordo con studi precedenti (8). La tabella S2 fornisce anche dati clinici e demografici per i pazienti di origine, classificandoli in base alla principale malattia di base: malattia medica, malignità, IE, o chirurgia/trauma. Tutti i soggetti con IE sono stati diagnosticati clinicamente, e tutti tranne il caso VMC56 (Tabella S2) sono stati classificati come “IE definitiva” secondo i criteri Duke modificati (16). L’unica eccezione aveva una storia di precedente IE e l’uso di droghe per via endovenosa (IVDU), che di concerto con le colture di sangue positivo risulterebbe nella categorizzazione come “possibile IE”. Sono stati esaminati anche i dati sulle possibili fonti di infezione, tra cui linee centrali, endoscopia gastrointestinale, mucosite orale, condizioni dentali e IVDU. IVDU è stato trovato per 9 dei 13 pazienti con IE e solo per 1 altro paziente nello studio (Tabella S2). Questa differenza era statisticamente significativa (P < 0,0001; test esatto di Fisher). Quindi, anche se questo studio si è concentrato sulle specie orali, IVDU era un fattore di rischio schiacciante.

La nostra analisi filogenetica non ha scoperto associazioni statisticamente significative tra qualsiasi specie particolare o tipo clonale e la malattia sottostante o altri parametri clinici, compresa la conta dei globuli bianchi, la temperatura più alta, la dimensione della vegetazione, la valvola colpita o la morte del paziente. Uno studio precedente conteneva abbastanza informazioni per identificare le specie isolate da pazienti neutropenici (12). I nostri risultati sono stati simili, in quanto 11 dei 12 isolati in quello studio e 9 dei 10 nel nostro (Tabella S2) erano S. mitis o S. oralis, strettamente correlati. Nel nostro studio, queste due specie, prese insieme, erano significativamente più probabili delle 12 specie rimanenti combinate per essere isolate da pazienti neutropenici (P = 0,004; test esatto di Fisher). Ciò può riflettere la prevalenza di queste specie nella cavità orale. È interessante, tuttavia, che questa tendenza non si sia trasferita all’IE. Combinando i nostri dati con quelli dello stesso studio (12) per neutropenia e IE, S. oralis e S. mitis sono stati isolati da 20 dei 22 casi di neutropenia e solo 15 dei 27 casi di IE, una differenza che era statisticamente significativa (P = 0,01; test esatto di Fisher). Come negli studi precedenti (11, 12, 30), il numero di campioni ha limitato la nostra capacità di valutare con sicurezza altre possibili associazioni tra le specie e particolari malattie o caratteristiche cliniche. Tuttavia, accoppiando l’identificazione definitiva della specie con le caratteristiche cliniche e demografiche per ogni paziente di origine (Tabella S2), abbiamo cercato di rendere i nostri risultati adatti a meta-analisi o ad altri studi che utilizzano dati combinati.