Illustrato nella Figura 2(a) è il profilo di emissione della fluorescenza utilizzando il blocco di filtri DAPI-FITC e una coltura di cellule di fibroblasti di cervo indiano Muntjac colorate con Alexa Fluor 488 coniugato con falloidina, che si lega alla rete intracellulare di actina filamentosa. Il massimo di assorbimento della luce visibile di Alexa Fluor 488 è di 495 nanometri e il massimo di emissione si verifica a 519 nanometri nella regione verde dello spettro. Inoltre, il campione è stato colorato simultaneamente con DAPI (DNA di destinazione nel nucleo delle cellule; eccitazione a 358 nanometri ed emissione a 461 nanometri) e MitoTracker Red CMXRos (mitocondri di destinazione; emissione rossa). Si noti l’assenza di segnale dal fluoroforo rosso (MitoTracker), ma la presenza di fluorescenza verde brillante esposta dai filamenti di actina e il segnale blu di intensità leggermente inferiore da DAPI nel nucleo delle cellule.
Una sezione sottile di intestino di topo colorato con Alexa Fluor 350 agglutinina di germe di grano, una lectina blu fluorescente che è specifico per il muco delle cellule del calice, è presentato in Figura 2 (b). Inoltre, il campione è stato colorato contemporaneamente con Alexa Fluor 568 falloidina (actina filamentosa; 600 nanometro emissione) e SYTOX Green (nuclei; 504 nanometro eccitazione e 523 nanometro emissione). Si noti il basso livello di segnale dal fluoroforo blu (Alexa Fluor 350), ma la fluorescenza verde brillante dei nuclei nel campione di tessuto a causa della fluorescenza SYTOX Green. Questa combinazione di doppio filtro di eccitazione elimina efficacemente il segnale dal rosso (Alexa Fluor 568) sonda.
Figura 2 (c) dimostra l’intensità di emissione di fluorescenza da una cultura di canguro di ratto (PtK2) cellule epiteliali che sono stati immunofluorescentemente etichettati con anticorpi monoclonali primari anti-bovino alfa-tubulina del mouse seguita da capra anti-mouse Fab frammenti coniugati con Alexa Fluor 488. Inoltre, il campione è stato etichettato con Hoechst 33258, che si lega selettivamente al DNA nel nucleo delle cellule, e MitoTracker Red CMXRos (targeting mitocondri; fluorescenza rossa). Si noti la prominente colorazione verde della rete intracellulare di microtubuli che si estende in tutto il citoplasma, e l’emissione blu da Hoechst 33258 legato al DNA nel nucleo. La cellula nella parte inferiore dell’immagine sembra essere in fase di mitosi nello stato di prometafase o metafase.
Le cellule di topo svizzero (linea 3T3) marcate in immunofluorescenza con anticorpi monoclonali primari anti-citocromo ossidasi di topo seguiti da frammenti Fab di capra anti-mouse coniugati con Alexa Fluor 568 sono illustrate nella Figura 2(d). Il campione è stato anche etichettato con diverse sonde aggiuntive, tra cui lectina Helix pomatia agglutinina (HPA) coniugato ad Alexa Fluor 488 (emissione verde), che si lega selettivamente alle glicoproteine nell’apparato di Golgi in questa linea cellulare. I filamenti di actina citoscheletrica sono stati colorati con Alexa Fluor 680 (eccitazione rossa; emissione nel vicino infrarosso) e il DNA nucleare è stato etichettato con DAPI (emissione blu). Si noti la colorazione verde prominente dell’apparato di Golgi e l’intensità di fluorescenza blu osservata nei nuclei.
L’emissione di fluorescenza da una sezione sottile di rene di topo colorato con più (3) fluorofori è presentato in Figura 2 (e). I nuclei nella sezione di tessuto sono stati bersagliati con la sonda di acido nucleico DAPI, che ha un massimo di eccitazione a 358 nanometri e un massimo di emissione a 461 nanometri quando si lega al DNA in colture cellulari e sezioni di tessuto. Inoltre, la sezione del criostato è stata anche colorata simultaneamente con Alexa Fluor 488 agglutinina di germe di grano (glomeruli e tubuli convoluti) e Alexa Fluor 568 falloidina (actina filamentosa e il brush border). Si noti la presenza di segnale da entrambi i blu (DAPI) e verde (Alexa Fluor 488) sonde, ma l’assenza di arancione-rosso fluorescenza a causa di Alexa Fluor 568 coniugati nelle reti di actina e spazzola bordo.
L’emissione di autofluorescenza da un chicco di mais (Zea mays) sezione sottile è dimostrato in Figura 2 (f). L’autofluorescenza endogena nei tessuti vegetali deriva da una varietà di biomolecole, tra cui clorofilla, carotene e xantofilla. Nelle regioni di eccitazione ultravioletta e blu, la clorofilla ha una banda di assorbimento con un alto coefficiente di estinzione e produce una quantità significativa di fluorescenza quando viene eccitata con lunghezze d’onda tra 350 e 500 nanometri. Per il tessuto del chicco di mais illustrato sopra, si noti la presenza di un’intensità di emissione di autofluorescenza nelle regioni spettrali blu e verde, che è caratteristica della combinazione di filtri di fluorescenza Nikon DAPI-FITC.