La scoperta dei canali d’acqua (Aquaporins)

Abstract

Il movimento dell’acqua dentro e fuori le cellule è un processo biologico fondamentale che è essenziale per la vita. Tale movimento dell’acqua non solo regola l’attività delle singole cellule, ma è anche responsabile del funzionamento di molti sistemi di organi e del mantenimento dell’equilibrio idrico del corpo intero. Da tempo si sospettava che il movimento dell’acqua attraverso le membrane cellulari biologiche fosse in qualche modo potenziato o facilitato da pori o canali, ma la ricerca per identificare questi canali è stata lunga e noiosa. Come spesso accade nella scienza, il segreto del canale d’acqua è stato infine scoperto per caso nel 1992 da Peter Agre e dai suoi colleghi della Johns Hopkins University di Baltimora, che stavano lavorando sulle proteine di membrana dei globuli rossi. Questo “primo” canale d’acqua era originariamente chiamato CHIP28 ed è ora conosciuto come aquaporina 1. Agre ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2003 per questa scoperta. Ci sono attualmente 13 acquaporine conosciute nei mammiferi, distribuite nella maggior parte dei tessuti, ma molte altre sono state identificate in organismi inferiori e nel regno vegetale. Il coinvolgimento delle acquaporine in processi come la concentrazione urinaria e l’omeostasi dei fluidi corporei, la funzione cerebrale, la secrezione ghiandolare, l’idratazione della pelle, la fertilità maschile, l’udito, la vista e le funzioni corporee più importanti che si possano immaginare sono ora tutte sotto intenso esame scientifico. Inoltre, i difetti nella funzione dell’acquaporina sono stati collegati a varie condizioni di malattia e stati patologici. Questa breve rassegna discuterà il loro background, la loro scoperta e la loro funzione in determinati processi corporei, concentrandosi in particolare sull’idratazione.

© 2017 The Author(s) Published by S. Karger AG, Basel

Perché siamo interessati ai canali d’acqua?

Le cellule che costituiscono il nostro corpo sono costituite principalmente da acqua. Circa il 65% di una cellula è acqua. In termini di massa corporea totale, i bambini sono i più “succosi”, essendo composti dal 75% di acqua; gli adulti magri contengono il 60% di acqua, mentre gli anziani contengono solo il 50% di acqua. La maggior parte del peso secco, non acqua, nel corpo è costituito da ossa. Per fare un paragone, forse l’organismo più ricco d’acqua è la lattuga (95% di acqua), mentre noi umani siamo paragonabili a una banana (65% di acqua). Durante l’evoluzione, le cellule di tutti gli organismi si sono evolute per lavorare in modo ottimale in un ambiente acquoso, e variazioni significative nel contenuto cellulare di acqua concentreranno o diluiranno i loro componenti molecolari e impediranno il normale funzionamento. Così, le cellule hanno bisogno di regolare la quantità di acqua che entra ed esce attraverso la loro membrana plasmatica per regolare la concentrazione citosolica di soluti, ioni, elettroliti, proteine e acidi nucleici. Inoltre, anche la quantità di acqua negli spazi extracellulari di un organismo è strettamente controllata. Negli esseri umani e in altri mammiferi, questo include, ma non è limitato al volume del sangue, lo spazio interstiziale al di fuori dei vasi sanguigni, il liquido cerebro-spinale, l’umore acqueo nell’occhio e le secrezioni ghiandolari.

Perché abbiamo bisogno di canali d’acqua?

Per far fronte alle richieste metaboliche in costante cambiamento e alle condizioni circostanti, le cellule devono scambiare rapidamente acqua tra il loro citoplasma (interno) e l’ambiente esterno (esterno) per mantenere un volume costante. Questo è importante per molti organismi inferiori che hanno sviluppato elaborati meccanismi per la regolazione del volume cellulare, e di solito coinvolge non solo il trasporto di acqua ma anche i flussi di ioni (soprattutto Na+, K+ e Cl-) attraverso le membrane per recuperare da un eccessivo gonfiore o restringimento quando sono esposti a fluidi esterni di diversa osmolalità (ad esempio, da acqua di mare salata ad acqua piovana diluita). Mentre questi meccanismi di trasporto degli ioni esistono anche nei mammiferi, gran parte della funzione di regolazione “omeostatica” negli organismi superiori si ottiene mantenendo un ambiente interno costante in cui risiedono le nostre cellule – il famoso “milieu intérieur” o “il mare interno” definito da Claude Bernard. Questo si ottiene in gran parte grazie all’azione dei reni, in coordinamento con il cervello che rileva il volume e la concentrazione del plasma (osmolalità), e poi reagisce aumentando o riducendo la quantità di acqua che rilascia nell’urina. Questo sarà discusso in dettaglio più avanti.

Oltre a mantenere il volume delle cellule, il rapido scambio di acqua attraverso le cellule permette ai tessuti e agli organi di secernere e/o assorbire acqua come parte della loro funzione fisiologica. Le cellule epiteliali che rivestono alcuni tubuli renali sono particolarmente adatte a questa funzione, ma anche le cellule di altri organi possono regolare il movimento dell’acqua transepiteliale per permettere il verificarsi di processi importanti dal punto di vista funzionale. Per esempio, i fluidi secreti dal pancreas, dal dotto biliare, dalle ghiandole lacrimali, salivari e mammarie, così come il plesso coroideo e l’epitelio pigmentato della retina, comportano tutti un rapido movimento transepiteliale dell’acqua.

Come l’acqua entra ed esce dalle cellule?

Tutti questi processi fisiologici comportano il movimento dell’acqua attraverso le membrane cellulari. Si è capito da tempo che quando la maggior parte delle cellule sono poste in acqua distillata, si gonfiano considerevolmente e alla fine possono scoppiare. Al contrario, quando le cellule sono poste in una soluzione salina che è più concentrata dei sali e degli altri componenti del loro citoplasma, si restringono. Questo processo è dovuto in gran parte al flusso osmotico dell’acqua, su o giù per un gradiente di concentrazione, nel tentativo del sistema di equilibrare la concentrazione osmotica su entrambi i lati della membrana plasmatica cellulare. Ma come si muove esattamente l’acqua attraverso la membrana cellulare? Usando uno speciale dispositivo che può misurare il rigonfiamento e il restringimento dei globuli rossi, un modello sperimentale facile da ottenere e manipolare, i ricercatori hanno concluso che l’acqua ha 2 percorsi attraverso le membrane. Quando il rigonfiamento e il restringimento osmotico sono stati monitorati a diverse temperature, Solomon ha scoperto un processo lento e sensibile alla temperatura a cui si sovrapponeva un processo molto più rapido e indipendente dalla temperatura (Fig. 1). Il processo lento rifletteva la permeabilità diffusiva dell’acqua attraverso il bilayer lipidico grasso della membrana plasmatica – la diffusione è sensibile alla temperatura. Ma il processo veloce era coerente con la presenza di pori acquosi nella membrana, che permetteva il passaggio più rapido e osmoticamente guidato dell’acqua che non comportava la diffusione (Fig. 1). Macey e Farmer e altri hanno poi dimostrato che il composto cloruro mercurico poteva inibire significativamente la componente veloce di questo processo, il che suggeriva la presenza di un poro proteico – o canale d’acqua – all’interno della membrana. Il cloruro mercurico si lega ai gruppi sulfidrilici (residui di cisteina) sulle proteine e inibisce la loro funzione: in questo caso, la permeabilità all’acqua. Così, questa ricerca che si è concentrata sui globuli rossi ha chiaramente verificato il concetto che i pori d’acqua sono responsabili del passaggio rapido, insensibile alla temperatura e osmoticamente guidato dell’acqua attraverso le membrane biologiche. Come vedremo, questi pori sono stati successivamente identificati come acquaporine.

Il rene regola il contenuto d’acqua del nostro corpo

Il rene è un organo notevole che è meglio conosciuto per “filtrare” il sangue per rimuovere prodotti di scarto come l’urea e altre tossine e per produrre urina. Circa 180 L di sangue vengono filtrati ogni giorno, ma la maggior parte degli individui produce solo circa 1,5 L di urina. La quantità precisa dipende da quanto si beve, da quanto fa caldo e da quanto si fa esercizio fisico (che causa la perdita di acqua attraverso la sudorazione). Circa il 90% del liquido filtrato viene rimosso nelle regioni prossimali del rene e questo valore è abbastanza costante nella maggior parte delle persone. Tuttavia, il restante 10% (18 L) viene riassorbito nel condotto di raccolta del rene sotto l’influenza dell’ormone antidiuretico, la vasopressina (VP). La VP è rilasciata dall’ipofisi posteriore in risposta alla disidratazione (che si traduce in un aumento della concentrazione osmotica del siero) o alla perdita di volume. Agisce sulle cellule epiteliali del dotto collettore del rene attraverso un recettore specifico chiamato recettore della vasopressina (V2R) per stimolare il riassorbimento dell’acqua, che corregge il problema e ripristina la concentrazione e/o il volume del sangue a livelli normali. Il meccanismo con cui la VP provoca questo assorbimento di fluido attraverso l’epitelio del dotto collettore è ora abbastanza ben compreso e coinvolge i canali dell’acqua dell’aquaporina.

La vescica urinaria del rospo come modello per il rene

È utile fare un passo indietro e guardare come il meccanismo d’azione della VP è stato esaminato sperimentalmente. Mentre gli effetti del VP sulla funzione renale erano ben noti da tempo, una dissezione dettagliata della sua azione cellulare richiedeva un sistema modello più accessibile del rene. È molto difficile (ma non impossibile) lavorare con i singoli tubuli renali, poiché sono molto piccoli – solo circa 40 µm di diametro. Una svolta importante nella ricerca è arrivata quando Bentley (e altri) hanno scoperto che la vescica urinaria del rospo trasportava anche acqua in risposta all’ormone antidiuretico. Questa è una parte naturale del loro processo di sopravvivenza in natura. Quando è immerso nell’acqua, il rospo assorbe l’acqua attraverso la sua pelle e produce molta urina molto diluita, che immagazzina in una grande vescica a palloncino. Quando il rospo ha un accesso limitato all’acqua dello stagno e comincia a disidratarsi, il suo ormone antidiuretico (chiamato vasotocina, un analogo della VP) viene rilasciato e fa sì che l’epitelio della vescica diventi permeabile all’acqua. Così, l’acqua immagazzinata nella vescica viene restituita al sangue per reidratare la creatura. In sostanza, il rospo porta con sé la propria acqua in bottiglia nella vescica. La vescica urinaria del rospo è così diventata un surrogato ampiamente utilizzato per esaminare e comprendere il flusso d’acqua indotto dalla VP attraverso l’epitelio del dotto di raccolta del rene.

Per molti anni, la vescica del rospo è stata utilizzata per esaminare l’insorgenza e la compensazione dell’azione della VP sul flusso d’acqua nelle cellule epiteliali. Sono state identificate molte vie di segnalazione cellulare che regolano questo processo a valle dell’interazione VP-recettore. Uno dei risultati più intriganti emersi dai numerosi studi sulla vescica di rospo è stato il concetto di canali d’acqua inseriti nella membrana plasmatica di queste cellule epiteliali per aumentare la permeabilità della membrana e quindi dell’acqua epiteliale. Dopo il ritiro dell’ormone, questi “canali d’acqua” verrebbero poi rimossi dalla membrana plasmatica per internalizzazione nella cellula (un processo noto come endocitosi), che ripristina la membrana al suo stato di base impermeabile e impedisce il flusso di acqua. Questa idea è stata pubblicata da Wade che ha coniato il termine “ipotesi navetta” per descrivere il movimento avanti e indietro dei canali d’acqua da e verso la superficie cellulare per analogia con la navetta spaziale della NASA. Ma la natura di questi canali d’acqua rimaneva sconosciuta.

La scoperta dei canali d’acqua Aquaporin

Nonostante i numerosi tentativi di identificare la proteina che formava i canali d’acqua, il campo è rimasto essenzialmente congelato nel tempo per molti anni. Tutti i tentativi diretti di isolare la proteina da membrane purificate di eritrociti della vescica di rospo e del rene avevano avuto un successo limitato, anche se alcune pubblicazioni si avvicinavano e altre fornivano informazioni importanti, come quelle sulla dimensione molecolare (circa 30 kD). E così è successo che il gruppo Agre, guardando le proteine del fattore Rhesus nelle membrane dei globuli rossi, ha notato una banda “contaminante” coerente sui loro gel a circa 28 kD. Piuttosto che scartare questa informazione, hanno scavato un po’ più a fondo e hanno concluso che questo potrebbe essere il tanto ricercato canale d’acqua nei globuli rossi. È stato isolato e purificato, e gli anticorpi hanno mostrato che era espresso anche nelle cellule dei tubuli prossimali del rene e nel sottile arto discendente di Henle – entrambi sono costitutivamente altamente permeabili all’acqua. Potrebbe essere questo il canale dell’acqua? Il momento decisivo è arrivato quando il gruppo Agre ha iniettato l’mRNA che codifica questa proteina in un sistema di espressione in vitro, gli ovociti di Xenopus. La membrana dell’ovocita è normalmente molto impermeabile all’acqua – le uova sono depositate in acqua dolce e scoppierebbero se la membrana fosse permeabile! Ma dopo l’iniezione di mRNA che codifica per il canale putativo dell’acqua, gli ovociti caduti in acqua distillata hanno fatto esattamente questo – sono scoppiati, mentre gli ovociti di controllo sono rimasti intatti. Il gruppo Agre si rese conto che l’mRNA iniettato aveva costretto gli ovociti a produrre una nuova proteina che, quando si spostava sulla membrana dell’ovocita attraverso meccanismi di trasporto cellulare, faceva sì che la membrana diventasse altamente permeabile all’acqua. Seguirono molti festeggiamenti. Una serie di articoli successivi confermò che questa nuova proteina, chiamata CHIP28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kD), era il primo canale d’acqua ad essere definitivamente identificato.

La famiglia delle acquaporine

Poco dopo che l’identità molecolare di CHIP28 divenne nota, altri trovarono una serie di proteine omologhe che formavano una nuova famiglia. Sono diventate note come acquaporine. Quando il nome fu usato per la prima volta, c’erano 4 acquaporine conosciute nei mammiferi – AQP1, 2, 3 e 4. Ora ci sono 13 acquaporine dei mammiferi, e centinaia sono state identificate in altri organismi, comprese le piante. Tutte queste hanno le stesse caratteristiche strutturali generali, con un peso molecolare di circa 30 kD nella forma non glicosilata, e diversi stati di glicosilazione che risultano in un peso molecolare superiore. Tutte hanno 6 domini transmembrana; le estremità C e N sono entrambe nel citoplasma; formano un tetramero funzionale nel bilayer lipidico e la struttura del poro d’acqua all’interno della proteina è stata chiarita dalla cristallografia a raggi X per alcune delle acquaporine. Inaspettatamente, alcune acquaporine sono più permeabili all’acqua di altre, e alcune possono trasportare altre molecole oltre all’acqua. Per esempio, AQP3 è permeabile al glicerolo, e AQP9 è permeabile all’urea. Inoltre, alcune acquaporine sono permeabili ai gas come CO2 e NO. Quindi, il campo della biologia delle acquaporine è in continua espansione, e i rapporti di nuove e inaspettate funzioni all’interno di varie cellule e tessuti continuano ad emergere regolarmente.

Aquaporina 1 e 2 (il canale dell’acqua sensibile al VP) nel rene

AQP1, il canale dell’acqua delle cellule rosse, è altamente espresso nei tubuli prossimali e nei sottili arti discendenti di Henle, entrambi altamente permeabili all’acqua in ogni momento. Questi segmenti di tubuli sono coinvolti nel riassorbimento del 90% dell’acqua filtrata. Una seconda acquaporina, AQP2, è stata identificata nelle cellule principali del dotto collettore del rene. Queste sono le cellule che (come la vescica di rospo) cambiano la loro permeabilità all’acqua in risposta all’ormone antidiuretico, VP, e regolano così il riassorbimento del liquido rimanente – quasi 20 L al giorno. AQP2 è il canale dell’acqua regolato dal VP. In presenza di VP, AQP2 si accumula sulla superficie delle cellule principali e l’acqua attraversa l’epitelio guidata da un gradiente osmotico (Fig. 2). L’aspetto basolaterale di questi tubuli è ipertonico rispetto al fluido nel lume del tubulo e l’acqua scorre in discesa lungo questo gradiente in presenza di VP. La membrana basolaterale delle cellule principali è sempre permeabile all’acqua a causa della presenza di AQP3 o AQP4 in diverse parti del rene. Quindi, la quantità di AQP2 nella membrana apicale è il fattore limitante che regola il riassorbimento dell’acqua nel dotto collettore del rene. Molti anni di ricerca hanno dimostrato che l’AQP2 si ricicla tra la membrana plasmatica e le vescicole citoplasmatiche nelle cellule principali, e la VP cambia l’equilibrio in modo che più AQP2 si accumula sulla superficie cellulare e meno è all’interno della cellula, rendendo conto dell’aumento della permeabilità della membrana (Fig. 2). La biologia cellulare alla base di questo processo è parzialmente compresa, e coinvolge una cascata di segnalazione che viene avviata dall’interazione della VP con il suo recettore, l’attivazione di un’adenilciclasi per aumentare il cAMP intracellulare, l’attivazione della protein chinasi A e la fosforilazione della proteina AQP2. La fosforilazione è l’evento critico che causa l’accumulo di membrana di AQP2, e diversi laboratori sono coinvolti in studi volti a comprendere ulteriormente questo processo. Si rimanda il lettore interessato a recenti recensioni dettagliate su questo processo.

Patofisiologia delle acquaporine

Come ci si potrebbe aspettare, le acquaporine sono state implicate in diverse malattie, soprattutto nel rene (Fig. 3). Il malfunzionamento o le mutazioni in AQP2 o, più comunemente, in V2R, causano il diabete insipido nefrogenico (NDI), in cui i pazienti non sono in grado di concentrare l’urina e teoricamente potrebbero svuotare fino a 18 L di urina diluita ogni giorno, cioè la quantità normalmente riassorbita nel condotto di raccolta. A causa di altri meccanismi di compensazione, la maggior parte dei pazienti con NDI produce tra 5 e 10 L al giorno. Le terapie disponibili possono alleviare solo parzialmente i sintomi, ed è necessario lavorare ancora per trovare cure migliori. La causa più comune di NDI è nei pazienti in trattamento con litio per il disturbo bipolare. Il litio causa una grave downregulation del gene AQP2 per ragioni che non sono completamente comprese. Pur essendo una terapia molto efficace per il disturbo bipolare, questo e altri effetti collaterali rendono molti pazienti riluttanti a intraprendere un ciclo di terapia con il litio. Altri disturbi legati a AQP, per lo più identificati in modelli animali knockout, sono un difetto di concentrazione urinaria (gli esseri umani AQP1 sono stati identificati), cataratta (AQP0), ictus (AQP4), e pelle fragile a causa di idratazione difettosa (AQP3). AQP1 e AQP2 sono state anche implicate nella migrazione cellulare e nella guarigione delle ferite. Infine, il fascino delle acquaporine ha catturato l’immaginazione delle agenzie pubblicitarie coinvolte, per esempio, nell’industria cosmetica. Cercate su Google e vedrete!

Direzioni future

Un’area eccitante della biologia delle acquaporine è l’emergere delle cosiddette funzioni lunari di queste proteine canale. Queste possono essere legate alla loro funzione di canale, come nel caso della permeabilità ai gas di AQP1, o non collegate all’attività del canale come nel caso di AQP2, che è coinvolto nello sviluppo del rene attraverso la sua interazione con le integrine e la matrice extracellulare. Gli studi futuri identificheranno senza dubbio altre proprietà inaspettate delle acquaporine. Un gran numero di acquaporine si trova in specie “inferiori” non-mammifere come piante, microbi e funghi. Questo apre la porta all’utilizzo di queste informazioni per migliorare la crescita e l’adattamento delle piante stimolando la funzione delle AQP, e per combattere le infezioni microbiche e fungine inibendo le acquaporine. Tali inibitori specifici non sono ancora disponibili, ma se e quando sviluppati, potrebbero anche avere ruoli importanti in medicina come aquaretics (per trattare l’ipertensione), e forse nel cancro (per bloccare le metastasi). Abbiamo anche molto da imparare sulla biologia cellulare del traffico delle acquaporine. Come si muovono nella cellula? Come interagiscono con altre proteine? Possono essere identificati percorsi di segnalazione alternativi e sfruttati per aggirare la segnalazione difettosa di V2R in NDI? Questo lavoro è in corso e promette di rivelare segreti cellulari che riguardano non solo la biologia delle AQP ma anche altri importanti eventi di traffico cellulare che sono implicati in una serie di altre malattie umane.

Acknowledgements/Disclosure Statement

D.B. e i suoi colleghi del MGH Program in Membrane Biology hanno ricevuto un sostegno continuo per il lavoro sulle acquaporine dal National Institutes of Health, attualmente con il numero di borsa DK096586. D.B. ha ricevuto da Danone Research il rimborso delle spese di viaggio e di registrazione per partecipare alla conferenza scientifica H4H.

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