dNTP sta per desossiribosio nucleotide trifosfato impiegato nella PCR per espandere il filamento di DNA in crescita. dATP, dTTP, dGTP e dTTP sono quattro comuni dNTP usati nella PCR.
La funzione dei dNTP nella PCR è di espandere il filamento di DNA in crescita con l’aiuto della DNA polimerasi Taq. Si lega con il filamento di DNA complementare tramite legami idrogeno.
La PCR è una tecnica in vitro di sintesi del DNA. Lo scopo di eseguire la PCR è di generare copie multiple di frammenti di DNA di nostro interesse per visualizzarlo sotto l’elettroforesi del gel.
Lo scopo della PCR è di fare milioni di copie di DNA per varie applicazioni a valle come il sequenziamento del DNA o il microarray di DNA.
La reazione a catena della polimerasi è lo strumento ineguagliato usato nella ricerca genetica molecolare fin dalla sua scoperta. Modello di DNA, primer, tampone, Taq DNA polimerasi e dNTP sono gli ingredienti della PCR. Per capire il meccanismo della PCR dovremmo imparare l’importanza di ogni ingrediente usato in essa,
In questo articolo, stiamo discutendo uno degli ingredienti chiave della PCR che è il dNTPs. Esamineremo anche la sua struttura e perché è così importante.
Inoltre, parleremo anche del meccanismo di interazione dei dNTP e della Taq DNA polimerasi e del loro lavoro sul filamento di DNA in crescita.
Inoltre, parleremo del meccanismo di come i dNTP e la DNA polimerasi interagiscono e aiutano a far crescere il filamento di DNA.
Leggi ulteriormente sugli articoli relativi alla PCR,
- Ruolo del DMSO nella PCR: DMSO un potenziatore della PCR
- Funzione della DNA polimerasi taq nella PCR
- Linee guida per la progettazione di primer PCR
- Ruolo del MgCl2 nella reazione PCR
Temi chiave:
Cosa sono i dNTP?
I dNTP sono i nucleotidi artificiali usati nella PCR per sintetizzare nuovi filamenti di DNA, proprio come la replicazione del DNA. dATP, dTTP, dGTP, dTTP sono nucleotidi comuni presenti nel mastermix della PCR.
Struttura dei dNTP:
Il dNTP sta per desossiribosio nucleotide trifosfato.
Per capire i dNTP dobbiamo innanzitutto capire alcune terminologie di base come base, nucleotidi, nucleosidi, ribonucleotidi, deossiribonucleotidi, dideossi ribonucleotidi. Questi sono alcuni termini di base usati abitualmente in genetica, eppure la gente li ha fraintesi.
L’adenina e la guanina sono basi puriniche mentre la citosina e la timina sono basi pirimidiniche. Le basi azotate non possono formare direttamente il DNA. La spina dorsale di fosfato e lo zucchero pentoso sono inoltre necessari per creare una molecola di DNA.
Il nucleotide è composto da uno zucchero pentoso, un fosfato e una base azotata. Un nucleotide si lega con un altro nucleotide adiacente con un legame fosfodiestere, mentre un nucleotide si lega con un altro nucleotide sul filamento di DNA opposto con legami idrogeno.
L’immagine rappresenta la struttura del desossiribosio trifosfato, difosfato e monofosfato.
Leggi di più sulla struttura del DNA: Storia del DNA: La struttura e la funzione del DNA
Il fosfato presente nel nucleotide è il trifosfato, (tri-tre) quando il fosfato non è legato al nucleotide (o è assente), è chiamato nucleoside (il nucleotide senza fosfato è chiamato nucleoside).
Quando un atomo di idrogeno sostituisce il gruppo idrossile nello zucchero pentoso, lo zucchero è chiamato zucchero deoxy. Il DNA è composto da zucchero pentoso deossi, mentre l’RNA è composto dal solo zucchero ribosio.
I dNTP sono la catena di nucleotidi composta da ribosio, base azotata e fosfato.
Inoltre, i ddNTP sono diversi dai dNTP.
Il trifosfato disossinucleotidico non ha il gruppo 3′ OH libero, un altro gruppo 3′ OH dello zucchero è sostituito da idrogeno.
Quindi non può causare l’espansione di un filamento di DNA in crescita. Così questi tipi di ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP sono usati nel sequenziamento del DNA. Discuteremo il ruolo dei ddNTP nel sequenziamento in modo elaborato in un altro articolo.
I ddNTP sono usati nel metodo di terminazione a catena per fermare l’espansione della sintesi del DNA.
L’immagine rappresenta la differenza tra zucchero Ribosio, zucchero deossiribosio e zucchero deossiribosio.
Il trifosfato è composto da tre diverse molecole di fosfato che fornisce una spina dorsale al DNA.
La spina dorsale del DNA ha tre diverse molecole di fosfato chiamate fosfato alfa, beta e gamma. Quando un fosfato o un fosfato gamma viene rilasciato, la struttura è chiamata deossinucleotide difosfato.
Similmente quando due dei tre fosfati vengono rilasciati la struttura è chiamata deossinucleotide monofosfato.
dATP e dGTP sono purine mentre dCTP e dTTP sono dNTP pirimidinici usati nella reazione PCR. La funzione dei dNTP nella PCR è la stessa della replicazione in vivo. Se sei interessato a leggere le differenze tra nucleotidi vs nucleosidi e purine vs pirimidine leggi questi articoli:
- Purine Vs Pirimidine
- Nucleotidi Vs Nucleosidi
L’immagine rappresenta quattro diverse strutture di dNTPs.
La funzione dei dNTPs:
I dNTP sono gli ingredienti della PCR, RT-PCR, sequenziamento del DNA o microarray di DNA che aiuta a far crescere il DNA o l’amplificazione del DNA.
Meccanismo di azione:
Il processo di PCR è diviso in tre fasi dipendenti dalla temperatura:
- Denaturazione
- Annealing
- Estensione.
Nella fase di denaturazione, il DNA a doppio filamento viene denaturato in DNA a singolo filamento; nella fase di ricottura, il primer si lega nella posizione esatta in cui è presente la sua sequenza complementare e,
Nella fase di estensione, la Taq DNA polimerasi aggiunge i dNTP al filamento di DNA in crescita.
Una volta che il filamento è aperto e il primer si lega con il DNA a singolo filamento, la Taq DNA polimerasi inizia la sua attività catalitica.
La Taq DNA polimerasi usa il DNA a singolo filamento come substrato per l’attività enzimatica e si stabilisce sulla giunzione primer-DNA.
L’una estremità della Taq DNA polimerasi si lega vicino al gruppo 3′ OH del primer oligonucleotidico, questo complesso è chiamato complesso P- DNA.
L’immagine rappresenta la struttura del DNA con i legami idrogeno e il legame fosfodiestere del DNA.
Nella fase successiva, l’aggiunta del dNTP è iniziata.
Il dNTP si lega con il complesso P-DNA con debole affinità se il nucleotide complementare esatto è presente. Subito dopo la Taq DNA polimerasi lo trattiene e si verifica l’interazione del legame a idrogeno tra una base complementare e il dNTP.
Qui, all’inizio, non l’intero nucleotide ma la base (base azotata) presente sul dNTP decide se legarsi o meno.
Prima di tutto, se trova la base complementare sul modello ssDNA (A per T e G per C), formerà i legami a idrogeno tra loro. Si formano tre legami a idrogeno tra C e G e due legami a idrogeno tra A e T.
Una volta formato il legame a idrogeno, la Taq DNA polimerasi conforma il legame del dNTP con il filamento di DNA in crescita formando un legame fosfodiestere. Ora, dopo la formazione del legame fosfodiestere, la Taq DNA polimerasi fa un passo avanti per aggiungere nuovo dNTP.
Il legame fosfodiestere si forma tra il 3′ OH del primer e il 5′ P del dNTP.
Dopo la formazione del legame a idrogeno, la Taq DNA polimerasi catalizza la reazione rimuovendo il gamma e il beta-fosfato dal trifosfato del dNTP. Due pirofosfati (PPi) sono rilasciati dopo il completamento della reazione.
L’esatta cinetica di come i dNTP e la Taq polimerasi interagiscono durante la reazione PCR non è ancora nota.
Leggi di più su un’elettroforesi del gel di agarosio,
- Elettroforesi del gel di agarosio
- Tintura di caricamento del gel di DNA
- Ruolo di EtBr nell’elettroforesi del gel di agarosio
La concentrazione di dNTPs nella PCR:
In generale, per la reazione PCR con 30-35 cicli di una corsa, 200μM di ogni dNTPs sono sufficienti.
200μM ciascuno che significa un totale di 800μM di 4 miscele di dNTPs è utilizzato in una singola reazione PCR. Dobbiamo preparare la nostra concentrazione di lavoro dalla soluzione stock di 100mM.
Tuttavia, negli ultimi giorni il mastermix pronto all’uso è molto popolare ed efficace. Il mastermix pronto all’uso contiene tutti gli ingredienti importanti come la miscela dNTPs, il colorante per il caricamento del gel e la Taq DNA polimerasi.
Come studente di scienze dobbiamo appoggiarci, come preparare la soluzione di lavoro dal magazzino. Supponiamo di dover preparare 2mM di lavoro da 100mM di stock.
ora,
Ricordate V1C1= V2C2?
Qui, la concentrazione data C1 è 100mM (che è la concentrazione di stock di dNTPs)
V1 è il volume dato è sconosciuto (?)
C2 è la concentrazione richiesta = 2mM
V2 è il volume richiesto= 1000μL
Ora V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Ecco, 20μL di ogni dNTPs necessario per la preparazione della soluzione di lavoro così il volume finale per la nostra miscela è 80μL di (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) in 920μL di D/W.
Questo farà la concentrazione finale di 2mM di ogni dNTP in 1000μL di soluzione di lavoro. Calcola per 200μM da solo.
La mia guida definitiva per l’utilizzo dei dNTP nella PCR
Prepara sempre due provette di soluzione stock e conserva tutte le provette a -20°C.
Calcolate quante reazioni eseguite in una settimana di conseguenza preparate la soluzione di lavoro dalla soluzione stock e conservatela a 4°C. Perché il congelamento e lo scongelamento ripetuti diminuiranno l’attività dei dNTP.
Indossare sempre i glow e mantenere condizioni sterili durante la preparazione della soluzione di lavoro, perché la contaminazione del DNA estraneo ostacolerà la reazione PCR.
La concentrazione di 200μM è sufficiente per la reazione PCR, tuttavia, per la PCR a lungo raggio può essere usata una concentrazione da 2mM a 3 mM di ogni dNTP.
Come la concentrazione di dNTPs aumenta il tasso di legame non specifico aumenterà. Allo stesso modo, la scarsità di dNTPs porta a prodotti PCR incompleti. Quindi usa sempre una quantità appropriata di dNTPs.
Conclusione:
Concludentemente, la funzione dei dNTPs nella reazione PCR è importante quanto la Taq DNA polimerasi.
Con l’aiuto della Taq, i dNTP si legano al filamento di DNA in crescita e lo espandono. Se non vuoi pasticciare con tutta questa roba, puoi usare un kit PCR pronto all’uso che è più preferibile. Tuttavia, devi imparare il metodo manuale di preparazione dei reagenti.