Quando un bios campione viene crioconservato, il movimento molecolare e i processi cellulari rallentano fino al punto di transizione vetrosa in cui si ferma ogni attività, conservando cellule, tessuti e persino interi organismi per anni. Di conseguenza, non è una sorpresa che la crioconservazione sia al centro della maggior parte delle moderne operazioni di biobanca.
Ma anche se il concetto di congelamento è semplice, il processo fisico è piuttosto complesso. Il modo in cui avviene il congelamento o la vetrificazione può avere un impatto drammatico sulla vitalità delle cellule e sulla qualità del campione quando viene riportato a temperature più calde.
Esploreremo le proprietà fisiche del ghiaccio e i principali eventi del congelamento e dello scongelamento dei campioni (che è altrettanto importante del raffreddamento) in una serie di post sul blog che approfondiscono il processo di congelamento. In questo primo post, partiamo dall’inizio e diamo un’occhiata al primo passo del congelamento, la nucleazione.
L’acqua pura raffreddata al di sotto del punto di congelamento può rimanere un liquido super-raffreddato finché non viene disturbata. (Questo video qui sotto offre una grande illustrazione di questo punto ed è un grande esperimento scientifico da fare a casa con i bambini!)
Nel video, colpire una bottiglia d’acqua fornisce un sito per la formazione di cristalli di ghiaccio, o in altre parole, un sito di nucleazione. La nucleazione è un processo in cui le molecole di un liquido iniziano a raggrupparsi in piccoli ammassi, organizzandosi in un modo che definirà la struttura cristallina del solido. Ci sono due tipi di nucleazione:
- Nucleazione eterogenea, che si verifica quando il ghiaccio comincia a formarsi intorno a un sito di nucleazione, come un disturbo fisico, un’impurità (come il sale) nel liquido o un’irregolarità in un contenitore. Poiché i campioni biologici non sono mai acqua pura, sperimentano sempre una nucleazione eterogenea.
- Nucleazione omogenea, che si verifica quando il ghiaccio si forma senza alcun sito di nucleazione predefinito. L’acqua pura congela a circa -39°C in assenza di siti di nucleazione. In pratica, però, la nucleazione omogenea non si vede spesso a causa della rarità dell’acqua completamente pura.
Secondo una recensione sulla rivista Cryobiology, “La nucleazione del ghiaccio è la variabile non controllata più significativa nella crioconservazione convenzionale che porta alla variazione da campione a campione nel recupero, vitalità e funzione delle cellule”. Gli autori raccomandano di controllare il processo di nucleazione ed elencano diversi metodi di congelamento, molti dei quali sono comunemente usati per applicazioni IVF:
- Seeding: L’introduzione di un cristallo di ghiaccio esterno per promuovere la nucleazione ad una temperatura specifica. Per minimizzare i rischi di contaminazione, la semina è ora fatta generando un punto freddo all’esterno del contenitore, come le pinze fredde sul lato di una cannuccia.
- Nucleanti chimici: I cristalli nucleanti del ghiaccio sono inclusi nel mezzo del campione. I nucleanti chimici permettono un’ampia standardizzazione tra i tipi di campioni e sono un’area attiva di ricerca.
- Elettrocongelamento: L’elettricità ad alta tensione è usata per indurre la formazione di ghiaccio.
- Metodi meccanici: Scuotere, picchiettare o applicare ultrasuoni può essere efficace per la nucleazione, ma difficile da standardizzare.
- Raffreddamento shock/ congelamento a velocità controllata: Esporre il campione a una rapida serie di rampe di temperatura può promuovere la nucleazione. Questo è ciò che fa un congelatore a velocità controllata, accompagnando i campioni attraverso il processo di nucleazione.
- Spostamento di pressione: La nucleazione può essere indotta pressurizzando il campione, riducendo la temperatura, quindi rilasciando la pressione.
Per un’eccellente introduzione alle proprietà della formazione del ghiaccio nei sistemi biologici e più sul processo di nucleazione, controlla il capitolo uno del testo seminale del 2004 “Life in the Frozen State”, una lettura altamente raccomandata per chiunque sia interessato a conoscere più in dettaglio questi processi.