Van ‘t Hoff guadagnò la sua prima reputazione nel campo della chimica organica. Nel 1874, spiegò il fenomeno dell’attività ottica supponendo che i legami chimici tra gli atomi di carbonio e i loro vicini fossero diretti verso gli angoli di un tetraedro regolare. Questa struttura tridimensionale spiegava gli isomeri trovati in natura. Egli condivide il merito con il chimico francese Joseph Le Bel, che indipendentemente arrivò alla stessa idea.
Tre mesi prima che gli fosse conferito il dottorato, Van ‘t Hoff pubblicò questa teoria, che oggi è considerata la base della stereochimica, prima in un pamphlet olandese nell’autunno del 1874, e poi nel maggio successivo in un piccolo libro francese intitolato La chimie dans l’espace. Una traduzione tedesca apparve nel 1877, in un momento in cui l’unico lavoro che Van ‘t Hoff poteva trovare era alla Scuola Veterinaria di Utrecht. In questi primi anni la sua teoria fu largamente ignorata dalla comunità scientifica, e fu aspramente criticata da un importante chimico, Hermann Kolbe. Kolbe scrisse:
“Al Dr. J. H. van ‘t Hoff della Scuola Veterinaria di Utrecht non piace, apparentemente, l’indagine chimica esatta. Ha ritenuto più conveniente montare Pegaso (apparentemente preso in prestito dalla Scuola Veterinaria) e proclamare nel suo ‘La chimie dans l’espace’ come, nel suo audace volo verso la cima del Parnaso chimico, gli atomi gli siano apparsi disposti nello spazio cosmico.”
Tuttavia, dal 1880 circa il supporto alla teoria di Van ‘t Hoff da parte di importanti chimici come Johannes Wislicenus e Viktor Meyer ha portato al riconoscimento.
Nel 1884, Van ‘t Hoff pubblicò le sue ricerche sulla cinetica chimica, intitolate Études de Dynamique chimique (“Studi di dinamica chimica”), in cui descrisse un nuovo metodo per determinare l’ordine di una reazione usando i grafici e applicò le leggi della termodinamica agli equilibri chimici. Ha anche introdotto il concetto moderno di affinità chimica. Nel 1886, mostrò una somiglianza tra il comportamento delle soluzioni diluite e dei gas. Nel 1887, insieme al chimico tedesco Wilhelm Ostwald, fondò un’influente rivista scientifica chiamata Zeitschrift für physikalische Chemie (“Giornale di chimica fisica”). Lavorò sulla teoria di Svante Arrhenius sulla dissociazione degli elettroliti e nel 1889 fornì una giustificazione fisica per l’equazione di Arrhenius. Nel 1896, divenne professore all’Accademia Prussiana delle Scienze di Berlino. I suoi studi sui depositi di sale a Stassfurt furono un importante contributo all’industria chimica prussiana.
Van ‘t Hoff divenne docente di chimica e fisica al Veterinary College di Utrecht. Poi lavorò come professore di chimica, mineralogia e geologia all’Università di Amsterdam per quasi 18 anni prima di diventare alla fine il presidente del dipartimento di chimica. Nel 1896, Van ‘t Hoff si trasferì in Germania, dove finì la sua carriera all’Università di Berlino nel 1911. Nel 1901, ricevette il primo premio Nobel per la chimica per il suo lavoro con le soluzioni. Il suo lavoro dimostrò che le soluzioni molto diluite seguono leggi matematiche che assomigliano molto alle leggi che descrivono il comportamento dei gas.