00:00:07.25Ciao, mi chiamo Jennifer Doudna della UC Berkeley
00:00:09.26e sono qui oggi per parlarvi di come abbiamo scoperto
00:00:12.26una nuova tecnologia di ingegneria del genoma.
00:00:15.07Questa storia inizia con un sistema immunitario batterico
00:00:20.12che significa capire come i batteri
00:00:22.14lottano contro un’infezione virale.
00:00:24.26Si è scoperto che un sacco di batteri
00:00:28.04hanno nel loro cromosoma,
00:00:30.09che è quello che state guardando qui
00:00:32.15una sequenza di ripetizioni mostrata in questi diamanti neri
00:00:36.18che sono intervallati da sequenze
00:00:40.19 che derivano dai virus
00:00:43.08e sono state notate dai microbiologi
00:00:46.20che stavano sequenziando i genomi batterici ma nessuno sapeva
00:00:50.10 quale potesse essere la funzione di queste sequenze
00:00:53.06fino a quando si è notato che tendono a verificarsi anche
00:00:58.09con una serie di geni che spesso codificano proteine
00:01:03.29che hanno omologia con enzimi che fanno cose interessanti
00:01:09.03come la riparazione del DNA.
00:01:10.12Così era un’ipotesi che questo sistema
00:01:14.04che è stato chiamato CRISPR
00:01:16.08che è un acronimo per questo tipo di locus ripetitivo
00:01:19.14che questi sistemi CRISPR potrebbero effettivamente essere
00:01:22.29un sistema immunitario acquisito nei batteri
00:01:26.00che potrebbe consentire l’integrazione di sequenze
00:01:29.06da virus e poi in qualche modo utilizzato più tardi
00:01:32.07per proteggere la cellula da un’infezione
00:01:35.26con lo stesso virus.
00:01:37.05Quindi questa era un’ipotesi interessante
00:01:39.11e siamo stati coinvolti nello studio di questo
00:01:41.18a metà degli anni 2000 subito dopo la pubblicazione
00:01:44.15di tre articoli che indicavano
00:01:47.13l’incorporazione di sequenze virali
00:01:50.00in questi loci genomici.
00:01:52.07E così quello che è emerso nei prossimi anni
00:01:55.17era che in effetti questi sistemi CRISPR
00:01:58.08sono davvero sistemi immunitari acquisiti nei batteri
00:02:01.18quindi fino a questo punto nessuno sapeva che i batteri
00:02:04.24potessero avere un modo per adattarsi
00:02:08.08ai virus che entrano nella cellula
00:02:10.29ma questo è un modo in cui lo fanno
00:02:12.14e comporta il rilevamento del DNA estraneo
00:02:15.17che viene iniettato come mostrato in questo esempio
00:02:18.04da un virus che entra nella cellula
00:02:20.07il sistema CRISPR permette l’integrazione
00:02:26.06di brevi pezzi di quelle molecole di DNA virale
00:02:29.15nel locus CRISPR
00:02:31.07e poi nel secondo passo
00:02:33.27che è mostrato qui come biogenesi di CRISPR RNA
00:02:38.20Queste sequenze CRISPR sono effettivamente trascritte
00:02:42.20nella cellula in pezzi di RNA
00:02:45.15 che sono successivamente utilizzati insieme
00:02:48.23alle proteine codificate dai geni CAS
00:02:52.09questi geni associati a CRISPR
00:02:54.01per formare complessi interferenti o di interferenza
00:02:58.12che possono usare le informazioni nella forma
00:03:01.17di queste molecole di RNA per accoppiare le basi
00:03:04.08con sequenze corrispondenti nel DNA virale.
00:03:07.18 Quindi un modo molto ingegnoso che i batteri
00:03:10.12hanno escogitato per prendere i loro invasori
00:03:13.06e girare le informazioni della sequenza contro di loro.
00:03:17.00 Quindi nel mio laboratorio
00:03:20.21siamo stati molto interessati per molto tempo
00:03:23.09 a capire come le molecole di RNA
00:03:26.03sono usate per aiutare le cellule a capire
00:03:32.00come regolare l’espressione delle proteine
00:03:34.03dal genoma.
00:03:35.05E così questo sembrava anche un esempio molto interessante
00:03:37.27 di questo e
00:03:39.18abbiamo iniziato a studiare i meccanismi molecolari di base
00:03:42.24da cui questo percorso opera.
00:03:45.01E nel 2011 sono andato a una conferenza scientifica
00:03:49.23e ho incontrato una mia collega,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier che si vede in questa foto
00:03:56.10all’estrema sinistra e il laboratorio di Emmanuelle
00:03:58.14lavora su problemi di microbiologia e sono
00:04:02.11particolarmente interessati ai batteri
00:04:04.00che sono patogeni umani.
00:04:06.01Studiava un organismo chiamato
00:04:08.03Streptococcus pyogenes che è un batterio
00:04:11.15 che può causare infezioni molto gravi negli esseri umani
00:04:14.25e ciò che era curioso in questo bug era che
00:04:16.25ha un sistema CRISPR e in quell’organismo
00:04:19.06c’era un singolo gene che codificava una proteina
00:04:21.27conosciuta come Cas9
00:04:23.12che aveva dimostrato geneticamente di essere richiesta
00:04:26.09per la funzione del sistema CRISPR
00:04:28.16in Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23ma all’epoca nessuno sapeva quale fosse la funzione
00:04:33.05di quella proteina.
00:04:34.20E così ci siamo riuniti e abbiamo reclutato
00:04:37.20persone dei nostri rispettivi laboratori di ricerca
00:04:40.26per iniziare a testare la funzione di Cas9.
00:04:43.17Le persone chiave del progetto
00:04:45.20sono mostrate qui nella fotografia
00:04:48.00al centro c’è Martin Jinek
00:04:50.03che è un associato post-dottorato nel mio laboratorio
00:04:52.17e accanto a lui con la camicia blu
00:04:54.22è Kryztof Chylinski che era uno studente
00:04:57.20nel laboratorio di Emmanuelle
00:04:58.26e quindi questi due ragazzi insieme a
00:05:00.21Ines Fonfara che è all’estrema destra,
00:05:02.10un postdoc con Emmanuelle
00:05:04.01hanno iniziato a fare esperimenti attraverso l’Atlantico
00:05:07.25e a condividere i loro dati.
00:05:10.09E quello che hanno scoperto è che
00:05:13.06Cas9 è effettivamente una proteina affascinante
00:05:16.04che ha la capacità di interagire con il DNA
00:05:19.28e generare una rottura a doppio filamento
00:05:22.02nel DNA in sequenze che corrispondono
00:05:25.06alla sequenza in un RNA guida
00:05:27.08e in questa diapositiva si vede
00:05:29.06che l’RNA guida
00:05:30.10e la sequenza della guida in arancione
00:05:32.11si accoppia con un filamento
00:05:34.18del DNA a doppia elica
00:05:37.11e molto importante questo RNA
00:05:39.28interagisce con una seconda molecola di RNA
00:05:42.09chiamata tracr che forma una struttura
00:05:46.03che recluta la proteina Cas9
00:05:47.29per cui questi due RNA e una singola proteina
00:05:50.13in natura sono ciò che sono necessari
00:05:52.23per questa proteina per riconoscere
00:05:56.05quelli che normalmente sarebbero DNA virali
00:05:58.11nella cellula e la proteina
00:06:01.13è in grado di tagliarli,
00:06:02.14letteralmente rompendo il DNA a doppia elica.
00:06:05.24E così quando abbiamo capito questo
00:06:08.14abbiamo pensato: non sarebbe fantastico
00:06:10.26se potessimo effettivamente generare un sistema più semplice
00:06:13.29come ha fatto la natura
00:06:15.02 collegando insieme queste due molecole di RNA
00:06:18.04per generare un sistema che sarebbe una singola proteina
00:06:20.16e un singolo RNA guida.
00:06:22.28L’idea era di prendere fondamentalmente
00:06:25.17questi due RNA che vedete sul lato più lontano
00:06:29.29della diapositiva e poi fondamentalmente collegarli insieme
00:06:33.19per creare quello che chiamiamo
00:06:35.04un singolo RNA guida.
00:06:36.22Così Martin Jinek nel laboratorio
00:06:38.25 ha fatto quel costrutto
00:06:40.21e abbiamo fatto un esperimento molto semplice
00:06:44.22per testare se avevamo veramente
00:06:46.18un enzima programmabile di scissione del DNA
00:06:49.29e l’idea era di generare brevi RNA guida singoli
00:06:54.04che riconoscono diversi siti in una molecola di DNA circolare
00:06:59.24 che vedete qui
00:07:00.21e gli RNA guida sono stati progettati
00:07:03.10per riconoscere le sequenze mostrate dalle barre rosse
00:07:06.17nella diapositiva e l’esperimento fu poi
00:07:10.16per prendere quel plasmide, quella molecola di DNA circolare
00:07:13.21e incubarla con due diversi enzimi di restrizione (o taglio),
00:07:18.27uno chiamato SalI che taglia
00:07:21.23il DNA più o meno a monte all’estremità
00:07:25.05del DNA in questa immagine
00:07:26.12nel riquadro grigio,
00:07:27.19e il secondo sito diretto
00:07:31.00dal RNA-guidato Cas9
00:07:33.13a questi diversi siti mostrati in rosso.
00:07:35.16E un esperimento molto semplice
00:07:37.19abbiamo fatto questa reazione di incubazione
00:07:39.26con DNA plasmidico e questo è il risultato
00:07:43.24e quindi questo è quello che state guardando
00:07:45.28è un gel di agarosio
00:07:47.29che ci permette di separare
00:07:49.16le molecole di DNA scisse
00:07:51.20e quello che potete vedere è che in ciascuna di queste corsie di reazione
00:07:54.22otteniamo una molecola di DNA di dimensioni diverse rilasciata
00:07:58.12da questo plasmide doppiamente digerito
00:08:00.16in cui la dimensione del DNA
00:08:03.29corrisponde alla scissione nei diversi siti
00:08:06.11diretti da queste sequenze di RNA guida
00:08:08.26indicate in rosso
00:08:10.24quindi questo è stato un momento davvero emozionante
00:08:12.29in realtà un esperimento molto semplice che era
00:08:15.15simile di un momento “A ha!”
00:08:17.03quando abbiamo detto che abbiamo davvero un enzima programmabile per tagliare il DNA
00:08:22.02e che possiamo programmarlo con un breve pezzo di RNA
00:08:24.15per tagliare essenzialmente qualsiasi sequenza di DNA a doppio filamento
00:08:28.07quindi la ragione per cui eravamo così eccitati
00:08:30.23per un enzima che può essere programmato
00:08:33.19per generare rotture di DNA a doppio filamento
00:08:36.01in qualsiasi sequenza è perché
00:08:39.00C’era una lunga serie di esperimenti
00:08:42.16nella comunità scientifica che ha mostrato
00:08:45.13che le cellule hanno modi di riparare le rotture del DNA a doppio filamento
00:08:49.26che portano a cambiamenti
00:08:52.02nell’informazione genomica del DNA
00:08:55.21quindi questa è una diapositiva che mostra che
00:08:58.20dopo che una rottura a doppio filamento è generata
00:09:01.14da qualsiasi tipo di enzima che potrebbe fare questo
00:09:04.13incluso il sistema Cas9
00:09:06.05queste rotture a doppio filamento in una cellula
00:09:09.07sono rilevate e riparate da due tipi di percorsi
00:09:13.15uno a sinistra che coinvolge
00:09:17.26l’end joining non omologo
00:09:20.07in cui le estremità del DNA sono legate chimicamente
00:09:24.07di nuovo insieme di solito con l’introduzione
00:09:26.18di una piccola inserzione o delezione
00:09:28.25nel sito della rottura
00:09:29.27e sulla destra
00:09:32.01è un altro modo in cui avviene la riparazione
00:09:34.00attraverso la riparazione diretta per omologia
00:09:37.22in cui una molecola di DNA donatore
00:09:39.14che ha sequenze che corrispondono a quelle
00:09:43.28fiancheggiando il sito della
00:09:45.12rottura a doppio filamento può essere integrata
00:09:48.05nel genoma nel sito
00:09:50.10della rottura per introdurre nuove informazioni genetiche
00:09:54.06nel genoma
00:09:55.15Quindi questo aveva dato a molti scienziati
00:09:59.04l’idea che se ci fosse uno strumento
00:10:01.04o una tecnologia che permettesse
00:10:03.05scienziati o ricercatori di introdurre
00:10:06.12interruzioni a doppio filamento in siti mirati
00:10:09.00nel DNA di una cellula poi insieme
00:10:12.12con tutti i dati di sequenziamento del genoma
00:10:14.21che sono ora disponibili sappiamo la
00:10:16.10intera sequenza genetica di una cellula
00:10:18.21e se si sapesse dove si è verificata una mutazione
00:10:21.20che causa una malattia per esempio
00:10:23.20si potrebbe effettivamente usare una tecnologia come questa
00:10:26.25per introdurre DNA che fisserebbe una mutazione
00:10:31.00o generare una mutazione
00:10:32.23che potresti voler studiare in un contesto di ricerca
00:10:35.04quindi il potere di questa tecnologia è
00:10:38.28realmente l’idea che ora possiamo generare
00:10:41.20questi tipi di rotture a doppio filamento
00:10:43.17nei siti che scegliamo come scienziati
00:10:46.17programmando Cas9 e poi permettere
00:10:48.13alla cellula di fare riparazioni che introducono
00:10:51.04 cambiamenti genomici nei siti di queste interruzioni
00:10:54.15ma la sfida era come generare le rotture
00:10:58.11in primo luogo e così un certo numero
00:11:00.09di strategie diverse erano state prodotte
00:11:03.24per fare questo in diversi laboratori
00:11:05.15La maggior parte di loro, e mostrerò
00:11:08.21due esempi specifici qui
00:11:10.17uno chiamato nucleasi a dita di zinco
00:11:12.25e l’altro dominio effettore TAL
00:11:15.02sono entrambi modi programmabili
00:11:18.08per generare rotture a doppio filamento nel DNA
00:11:20.21che si basano sul riconoscimento basato sulle proteine
00:11:23.29delle sequenze di DNA, quindi queste sono proteine
00:11:26.06che sono modulari, e possono essere generate
00:11:29.12in diverse combinazioni di moduli
00:11:31.22per riconoscere diverse sequenze di DNA
00:11:34.03funziona come tecnologia
00:11:37.18ma richiede un sacco di ingegneria proteica
00:11:40.24per farlo, e ciò che è veramente eccitante
00:11:43.16di questo enzima CRISPR/Cas9
00:11:46.11è che è una proteina programmata a RNA
00:11:49.25per cui una singola proteina può essere usata per
00:11:52.09qualsiasi sito di DNA dove noi
00:11:54.27vorremmo generare una rottura
00:11:56.13cambiando semplicemente la sequenza
00:11:58.16dell’RNA guida associato a Cas9
00:12:00.24per cui invece di affidarci al riconoscimento basato sulle proteine
00:12:03.06del DNA ci affidiamo al riconoscimento basato sull’RNA
00:12:06.04del DNA
00:12:08.26come mostrato in basso, quindi ciò che significa
00:12:11.03è che è solo un sistema
00:12:12.18 che è abbastanza semplice da usare
00:12:15.15 che chiunque abbia una formazione di base in biologia molecolare
00:12:19.05possa approfittare di questo sistema
00:12:20.29per fare ingegneria del genoma
00:12:22.20e quindi questo è uno strumento che davvero
00:12:26.06penso, riempie un componente essenziale
00:12:29.03e precedentemente mancante
00:12:30.24di quella che potremmo chiamare la cassetta degli attrezzi informatica della biologia
00:12:33.29 che include non solo la capacità
00:12:36.00di sequenziare il DNA e guardare
00:12:38.06 la sua struttura, sappiamo della
00:12:39.24della doppia elica dagli anni 50
00:12:42.00e poi negli ultimi decenni
00:12:44.18è stato possibile usare enzimi
00:12:46.09come gli enzimi di restrizione
00:12:47.26e la reazione a catena della polimerasi
00:12:49.09per isolare e amplificare particolari segmenti
00:12:52.19di DNA e ora con Cas9
00:12:55.10abbiamo una tecnologia che permette
00:12:57.15l’ingegneria del genoma facile
00:12:59.13che è disponibile per i laboratori di tutto il mondo
00:13:03.07per gli esperimenti che potrebbero voler fare
00:13:05.08e quindi questo è un riassunto della tecnologia
00:13:10.11del sistema a 2 componenti
00:13:11.29si basa sul paring delle basi RNA-DNA
00:13:14.16per il riconoscimento
00:13:15.21e molto importante per il modo
00:13:18.24 che questo sistema funziona
00:13:19.28è in realtà abbastanza semplice
00:13:21.18per fare qualcosa chiamato multiplexing
00:13:24.20che significa che possiamo programmare Cas9
00:13:27.00con più RNA guida diversi
00:13:28.23nella stessa cellula per generare
00:13:30.19multiple rotture e fare cose
00:13:32.06come tagliare grandi segmenti di un cromosoma
00:13:35.01e semplicemente cancellarli in un solo esperimento.
00:13:38.25E così questo ha portato a una vera esplosione
00:13:42.03nel campo della biologia e della genetica
00:13:45.19con molti laboratori in tutto il mondo
00:13:48.08che adottano questa tecnologia
00:13:49.25per tutti i tipi di applicazioni molto interessanti
00:13:51.15e creative
00:13:53.13e questa è una diapositiva
00:13:54.24 che in realtà è quasi obsoleta ora
00:13:56.11ma solo per darvi un senso
00:13:57.14del modo in cui il campo
00:14:00.07ha davvero preso piede
00:14:01.08così abbiamo pubblicato il nostro lavoro originale su Cas9
00:14:04.10nel 2012 e fino a quel punto
00:14:07.16 c’era pochissima ricerca
00:14:08.18in corso sulla biologia CRISPR da qualche parte
00:14:11.12era un campo molto piccolo
00:14:12.19e poi si può vedere che
00:14:13.27iniziando nel 2013 ed estendendosi
00:14:16.09fino ad ora c’è stata questa
00:14:17.21incredibile esplosione di pubblicazioni
00:14:20.16da parte di laboratori che stanno usando
00:14:22.09questa come tecnologia di ingegneria del genoma
00:14:24.01quindi è stato davvero molto eccitante per me
00:14:26.25come scienziato di base vedere quello che è iniziato
00:14:29.22come un progetto di ricerca fondamentale
00:14:31.12trasformato in una tecnologia che risulta
00:14:34.08essere molto utile per tutti i tipi
00:14:35.28di esperimenti eccitanti
00:14:37.07e volevo solo chiudere condividendo
00:14:40.07con voi alcune cose
00:14:42.17che sono in corso utilizzando questa tecnologia
00:14:44.17così naturalmente sul lato sinistro
00:14:47.13Molte cose di biologia di base che possono essere fatte ora
00:14:50.02con l’ingegneria di organismi modello
00:14:53.03e diversi tipi di linee cellulari
00:14:55.02che sono coltivate in laboratorio
00:14:56.21per studiare il comportamento delle cellule
00:14:58.13ma anche nella biotecnologia essendo in grado di
00:15:01.23fare cambiamenti mirati nelle piante
00:15:05.15e vari tipi di funghi che potrebbero essere molto
00:15:07.11utili per diversi tipi di applicazioni industriali
00:15:09.29e poi naturalmente in biomedicina
00:15:12.14con un sacco di interesse nel potenziale
00:15:14.14per usare questa tecnologia come strumento
00:15:17.03per arrivare davvero a nuove terapie
00:15:21.06per le malattie umane penso sia qualcosa
00:15:23.09che è molto eccitante ed è davvero qualcosa
00:15:26.05che è già all’orizzonte
00:15:27.09e poi questa diapositiva indica solo
00:15:30.20dove penso che vedremo questo andare
00:15:33.15in futuro con un sacco di interessanti
00:15:36.20e creative direzioni
00:15:39.03che stanno arrivando in diversi laboratori
00:15:41.02sia nei laboratori di ricerca accademici
00:15:43.19ma anche sempre più nei laboratori commerciali
00:15:45.29che permetteranno l’uso di questa
00:15:49.24tecnologia per tutti i tipi di applicazioni
00:15:52.18molte delle quali non avremmo nemmeno potuto
00:15:54.10immaginare nemmeno due anni fa.
00:15:56.05Quindi molto emozionante e voglio solo riconoscere un grande team
00:16:01.10di persone che sono state coinvolte nel lavoro
00:16:04.22nel progetto con me e abbiamo
00:16:06.07avuto un fantastico sostegno finanziario da vari gruppi
00:16:11.00come pure ed è stato un piacere
00:16:13.00di condividere questo con voi, grazie.