Immunoistochimica (IHC) è una potente tecnica basata sulla microscopia per la visualizzazione di componenti cellulari, per esempio proteine o altre macromolecole in campioni di tessuto. La forza dell’IHC è l’output visivo intuitivo che rivela l’esistenza e la localizzazione della proteina bersaglio nel contesto di diversi tipi di cellule, stati biologici, e/o localizzazione subcellulare all’interno di tessuti complessi.
La tecnica IHC è stata inventata negli anni 40 (Coons, Creech, & Jones, 1941) ed è usata abitualmente come uno strumento importante nella sanità e nella patologia, ad esempio per scopi diagnostici o per stratificare i pazienti per ottimizzare i regimi di trattamento. L’IHC è anche ampiamente utilizzato nella ricerca dove le molecole di interesse sono analizzate per studiare il loro ruolo nelle cellule e nei tessuti sia sani che malati a livello molecolare, cellulare o tissutale. Ci sono molti modi diversi per eseguire la visualizzazione degli obiettivi nei tessuti utilizzando metodi IHC o basati su IHC, ed esistono numerosi protocolli per diverse applicazioni e saggi. Anche se l’IHC è generalmente un metodo robusto e consolidato, i nuovi saggi hanno spesso bisogno di un’attenta ottimizzazione a seconda del tessuto o delle proprietà della proteina bersaglio, della molecola legante e/o del sistema reporter. Molti anni di sviluppo tecnico e l’enorme aumento della disponibilità di specifiche molecole leganti hanno notevolmente migliorato l’utilità e le aree di applicazione dell’IHC. I progressi nel campo delle tecniche e dei reagenti basati sull’IHC hanno permesso agli scienziati e ai fornitori di assistenza sanitaria di disporre di strumenti, saggi e biomarcatori più precisi. Inoltre, i progressi tecnici hanno permesso, ad esempio, la rilevazione simultanea altamente sensibile di più proteine nello stesso campione e la rilevazione delle interazioni proteina-proteina (vedi Proximity Ligation Assay).
Il classico saggio IHC è illustrato nella Figura 1 e comporta la rilevazione di epitopi espressi da una singola proteina-target all’interno di un campione di tessuto utilizzando un “anticorpo primario” capace di legare quegli epitopi con alta specificità. Dopo l’evento di legame epitopo-anticorpo, viene aggiunto un “anticorpo secondario” capace di legare l’anticorpo primario con alta specificità. L’anticorpo secondario è accoppiato a una molecola reporter e dopo l’evento di legame anticorpo-anticorpo, viene aggiunto un substrato chimico che reagisce con la molecola reporter per produrre un precipitato colorato nel sito dell’intero complesso epitopo-anticorpo.
Figura 1. Il principio di base dell’immunoistochimica.
Nell’illustrazione schematica (Figura 1) una sezione di tessuto fissata in paraffina in formalina viene colorata utilizzando un anticorpo primario diretto verso una specifica proteina bersaglio. Una soluzione contenente l’anticorpo primario viene aggiunta alla sezione di tessuto e agli anticorpi viene concesso del tempo per trovare e legarsi al loro bersaglio. Dopo questa fase, gli anticorpi non legati e in eccesso vengono lavati via e viene aggiunto l’anticorpo secondario. L’anticorpo secondario, che porta una molecola di collegamento con enzimi di perossidasi di rafano (HRP), viene anche lasciato un po’ di tempo per legarsi all’anticorpo primario, seguito da un altro lavaggio. In seguito, viene aggiunta la 3,3′ Diaminobenzidina (DAB). L’enzima HRP trasforma il substrato DAB in un precipitato marroncino che si deposita nel tessuto nel luogo della reazione, producendo così una rappresentazione visiva del punto in cui l’anticorpo primario ha legato per la prima volta il suo bersaglio.
Tecnologia
Preparazione del tessuto
Il tessuto gioca un ruolo centrale nell’esperimento ed è importante che sia trattato in modo da preservare gli epitopi e la morfologia corretta. L’elaborazione più comune per IHC è quella di preparare blocchi di tessuto fissati in formalina con inclusione di paraffina (FFPE). Lo scopo della fissazione in formalina è quello di produrre una reticolazione chimica delle proteine all’interno del tessuto. Questo pone fine a tutti i processi cellulari e congela i componenti cellulari nel luogo e nella conformazione in cui si trovavano al momento della fissazione e ne previene anche la degradazione. Dopo un’adeguata fissazione, il tessuto viene ulteriormente elaborato e infine incorporato in blocchi di paraffina, che vengono poi sezionati in fette sottili (di solito 4-10µm) usando un microtomo. Le sezioni sono trasferite su vetrini e lasciate aderire prima di un’ulteriore elaborazione.
A volte vengono utilizzati altri metodi di fissazione oltre alla formalina. Questi includono altri tipi di aldeidi o l’uso di diverse soluzioni alcoliche. La scelta migliore del fissatore dipende molto dal test. Un’alternativa comune al FFPE è quella di preparare campioni di tessuto congelati. In questo caso, il tessuto viene incorporato in un mezzo crioprotettivo e congelato, e la fissazione viene eseguita dopo la sezione. I tessuti congelati vengono sezionati in criostati e hanno il vantaggio di tempi di lavorazione brevi e di una migliore conservazione degli epitopi sensibili, ma spesso possono essere inferiori ai tessuti FFPE in termini di conservazione della morfologia istologica.
Recupero dell’antigene (epitopo)
Una preoccupazione associata ai fissativi reticolanti come la formalina, o al tempo troppo lungo trascorso nel mezzo fissativo è il mascheramento degli epitopi, che può impedire all’anticorpo primario di legarsi al suo target. Specialmente con i campioni FFPE, c’è spesso la necessità di ripristinare alcuni dei reticolati chimici e “recuperare” gli epitopi prima di procedere all’IHC vero e proprio. Ci sono diversi protocolli di recupero dell’antigene disponibili e le strategie principali includono il trattamento del vetrino di tessuto con calore, enzimi digestivi, detergenti o combinazioni di questi. Il metodo più comune per il recupero dell’antigene nei campioni FFPE è quello di bollire a pressione i vetrini di tessuto in un tampone acido di citrato per circa 15-20 minuti.
Il legame anticorpale
La qualità e la specificità della molecola di legame è fondamentale per qualsiasi tecnica basata su IHC, e la scelta del legante può influenzare direttamente il risultato, l’affidabilità e forse anche l’interpretazione del test. Gli anticorpi sono di gran lunga il tipo più comune di molecola legante utilizzata per IHC, e anche se la maggior parte degli anticorpi sono in grado di rilevare adeguatamente la molecola corretta di interesse, possono anche variare notevolmente nella loro specificità per il loro bersaglio previsto. Gli anticorpi con alta specificità sono quindi più affidabili nell’interpretazione del legame “on-target”, poiché producono poco o nessun legame “off-target” o “background”. Gli anticorpi che sono meno specifici possono produrre più legami off-target, e lo sfondo risultante può interferire con la corretta interpretazione dei veri segnali on-target. Ci sono due tipi principali di anticorpi: gli anticorpi policlonali che sono una miscela eterogenea di anticorpi che legano diversi epitopi sul bersaglio e gli anticorpi monoclonali che legano tutti lo stesso epitopo. Gli anticorpi policlonali sono spesso molto potenti grazie alla loro capacità di rilevare e legare più epitopi sullo stesso bersaglio. Tuttavia, gli epitopi che legano sono spesso poco definiti e con epitopi multipli e variabili-specificità viene la maggiore probabilità di eventi di legame fuori bersaglio e rumore di fondo. Tuttavia, la potenza degli anticorpi policlonali può essere vantaggiosa poiché la concentrazione di eventi di legame intorno alla molecola on-target di solito supera il potenziale rumore di fondo. Uno svantaggio è che gli anticorpi policlonali sono di solito risorse limitate poiché sono derivati da sieri animali. Gli anticorpi monoclonali, al contrario, hanno più continuità poiché possono essere prodotti in linee cellulari di ibridoma. Gli anticorpi monoclonali sono anche spesso ben definiti in termini di legame dell’epitopo, ma possono ancora generare risultati difficili da interpretare se la specificità è bassa o se l’epitopo target è presente in bassa abbondanza.
È necessaria un’attenta ottimizzazione e titolazione della concentrazione di anticorpi per ogni test, poiché il risultato dipende non solo dalla specificità e dall’affinità dell’anticorpo per il target, ma anche dalla concentrazione e dalla disponibilità di epitopi on-target e potenziali off-target presenti nel campione. Aggiungere troppi anticorpi al campione aumenterà il numero di possibili eventi di legame off-target a bassa affinità una volta che gli epitopi on-target sono saturi di leganti. Abbassando la concentrazione di anticorpi, gli eventi di legame off-target diventano più rari perché di solito hanno un’affinità inferiore rispetto agli eventi di legame on-target. Il rischio quando si cerca di ridurre lo sfondo mentre si usa un anticorpo a bassa affinità è che i segnali on-target sono contemporaneamente indeboliti al punto da fornire un risultato falso negativo.
Altri tipi di molecole leganti a volte utilizzati nelle tecniche basate su IHC includono affibbi, peptidi, frammenti di anticorpi o altre piccole molecole.
Sistemi di rilevazione
L’intero scopo di eseguire IHC è quello di ottenere una rappresentazione visiva di dove il bersaglio può essere trovato all’interno del tessuto sperimentale, e preferibilmente anche ottenere informazioni sul modello di espressione del bersaglio tra popolazioni cellulari eterogenee e/o localizzazioni subcellulari. Questo è esemplificato nella Figura 2, che illustra come diversi anticorpi sono utilizzati per visualizzare diversi compartimenti cellulari o tessuti all’interno di un tessuto complesso. Per visualizzare l’interazione bersaglio-anticorpo, qualche tipo di sistema di rilevamento che produce una macchia osservabile o segnale è necessario. Il metodo più comune per introdurre un sistema di rilevamento nell’esperimento è quello di utilizzare un anticorpo secondario che porta una molecola reporter pre-legata, cioè un enzima o un fluoroforo. Gli anticorpi secondari sono di solito mirati specificamente verso le molecole di anticorpi di una specie animale diversa. Per esempio, se l’anticorpo primario è cresciuto in un coniglio, allora l’anticorpo secondario deve essere cresciuto in un altro animale e mirato specificamente verso gli anticorpi di coniglio.
| Esofago | Magnificazione | ||
|---|---|---|---|
| Macchia ematossilina | Nessuna colorazione con anticorpi | ||
| TP63 CAB000083 |
Macchia nucleare | ||
| EGFR CAB000035 |
Colorazione membranosa | ||
| G6PD HPA000247 |
Colorazione citoplasmatica | ||
| LAMB2 (Laminina) CAB000053 |
Tessuto connettivo |
Figura 2. Visualizzazione di diversi obiettivi proteici in tessuti complessi. La colonna di destra mostra un ingrandimento delle immagini corrispondenti nella colonna di sinistra.
Nell’immagine IHC (Figura 2), sezioni consecutive di esofago umano macchiato utilizzando quattro diversi anticorpi permette un confronto diretto di diversi modelli di espressione delle proteine all’interno del tessuto e all’interno di compartimenti subcellulari. Le immagini superiori sono solo controcolorate con ematossilina per il confronto. L’anticorpo p63 macchia i nuclei cellulari in una popolazione di cellule che risiedono nella parte basale dell’epitelio esofageo. L’anticorpo EGFR (Epidermal growth factor receptor) sembra macchiare la stessa popolazione di cellule del p63, ma macchia le membrane cellulari invece dei nuclei. L’anticorpo G6PD (glucosio-6-fosfato deidrogenasi) colora il citoplasma di un repertorio più ampio di cellule epiteliali esofagee e anche di cellule residenti nel tessuto connettivo. L’anticorpo Laminina (LAMB2) colora solo le cellule e le strutture del tessuto connettivo sottostante l’esofago.
Per i campioni di tessuto FFPE il metodo di rilevamento più comune è quello di utilizzare reazioni enzimatiche per generare un precipitato colorato nel sito di legame degli anticorpi. Gli anticorpi secondari portano poi un enzima, ad esempio la perossidasi di rafano (HRP) o la fosfatasi alcalina (AP), che sono in grado di convertire cromogeni come la 3,3′ diamminobenzidina (DAB) o il 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/p-nitroblue tetrazolium chloride (BCIP/NBT) in precipitati marroni o bluastri che si depositano nel tessuto nel sito della reazione. Le macchie cromogeniche sono osservabili al microscopio ottico e di solito sono molto stabili per lunghi periodi di tempo, il che è vantaggioso se l’esperimento deve essere archiviato o rivisto in un momento successivo.
Per le sezioni di tessuto congelate è più comune usare anticorpi secondari legati a fluorofori che emettono un colore specifico (di solito verde, rosso o blu) quando vengono eccitati dalle corrette lunghezze d’onda della luce. Inoltre, i fluorofori di solito non sono stabili per lunghi periodi di tempo. Tuttavia, il vantaggio di usare i fluorofori è che forniscono un metodo semplice per eseguire esperimenti di doppia etichettatura in cui diversi anticorpi verso obiettivi multipli sono valutati nello stesso campione. Gli anticorpi secondari devono essere mirati verso diversi anticorpi primari ed essere accoppiati a diversi fluorofori. I diversi anticorpi secondari vengono poi osservati separatamente eccitandoli in sequenza con diverse lunghezze d’onda della luce. Questi diversi risultati di eccitazione sono salvati come immagini separate (o canali di colore) e possono in seguito essere sovrapposti per dedurre le co-localizzazioni delle proteine, ecc.
L’utilizzo di anticorpi secondari portatori di reporter per la rilevazione è di per sé una fase di amplificazione poiché diversi anticorpi secondari sono in grado di legare un singolo anticorpo primario, ma a volte sono necessari ulteriori passaggi di amplificazione per aumentare il segnale e la sensibilità dell’esperimento. In questi casi, l’anticorpo secondario può invece portare “molecole linker”, per esempio polimeri di biotina, che sono in grado di reclutare un maggior numero di molecole reporter in fasi successive. Questa strategia di amplificazione dei segnali è utile sia per i metodi di rilevazione enzimatica che fluorescente.
Counterstaining
Le colorazioni immunoistochimiche che utilizzano cromogeni spesso beneficiano dell’applicazione di una controcolorazione che aumenta il contrasto e facilita l’osservazione delle caratteristiche istologiche. Il tipo più comune di colorazione di contrasto usato per i campioni FFPE è l’ematossilina che macchia il citoplasma cellulare con un colore bluastro pallido, e macchia i nuclei cellulari con una sfumatura bluastra più scura. Le colorazioni fluorescenti di solito non sono controcolorate con l’ematossilina, poiché il metodo di rilevamento non è basato sulla microscopia ottica. Invece, il modo più comune per ottenere la controcolorazione per la fluorescenza è quello di etichettare i nuclei delle cellule aggiungendo coloranti fluorescenti che legano gli acidi nucleici. Dopo la reazione immunoistochimica vera e propria, gli unici passi rimanenti sono la copertura e la sigillatura del campione per la protezione e la conservazione a lungo termine. Il modo più comune è quello di “incollare” il coprioggetti al campione usando resine disponibili in commercio fatte apposta.
Esempi specifici
IHC è ampiamente usato sia nella ricerca che nella pratica clinica. Il progetto Human Protein Atlas (HPA) è un ottimo esempio di come l’IHC ad alta produttività sia utilizzato per ottenere una mappatura su larga scala del proteoma umano in una moltitudine di tessuti, tumori e cellule. Nel progetto HPA, una snella catena di produzione interna di anticorpi su larga scala facilita la generazione di anticorpi specifici, che dopo aver superato la caratterizzazione di base e i regimi di convalida, vengono utilizzati per colorare sistematicamente microarray di tessuto contenenti centinaia di nuclei di tessuto in un unico esperimento. Il sistema di IHC impiegato da HPA si basa molto sulla standardizzazione dei protocolli e sull’automatizzazione tramite macchine, ma la valutazione della titolazione ottimale per ogni anticorpo viene eseguita manualmente prima che l’anticorpo sia approvato per la colorazione sull’intero set di tessuti. Ogni nucleo di tessuto colorato viene annotato rispetto alla colorazione immunoistochimica nei tessuti e nei tipi di cellule, e successivamente pubblicato come immagine ad alta risoluzione sul portale web per essere visualizzato liberamente da chiunque.
Nella pratica clinica, l’IHC è usato principalmente in patologia per aiutare i medici a valutare i campioni di tessuto rispetto agli stati sani e o malati, per stabilire le diagnosi e per definire il sottotipo molecolare di diversi tipi di cancro. Un esempio specifico in cui l’IHC viene utilizzato a livello diagnostico è quando ai patologi viene presentato un campione di tumore metastatico e l’origine del tessuto del tumore primario è sconosciuta. In questi casi, i patologi usano un pannello di diversi anticorpi che mirano a proteine specifiche del tessuto, come l’antigene prostatico specifico per il cancro alla prostata, o il recettore degli estrogeni per i tumori ginecologici, o la citocheratina 20 per i tumori gastrointestinali (Gremel et al., 2014). Una volta fatta un’ampia classificazione, vengono utilizzati ulteriori anticorpi specifici del tessuto per individuare ulteriormente l’origine del tumore primario. Queste informazioni sono utili per scegliere la strategia migliore o più appropriata per la terapia farmacologica e/o per localizzare il tumore primario per la radioterapia e/o la chirurgia.
Riferimenti e link
Anticorpi comunemente usati per la diagnostica del cancro:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Istopatologia. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
A review on validating antibodies for IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Un database ad accesso aperto di anticorpi pubblicamente disponibili e la loro utilità in varie applicazioni:
IHC world – Protocolli, Forum, Prodotti, e altro:
Un clip YouTube che illustra IHC da BioGenexLaboratories: