H MODELS FOR TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF THE β-GLOBIN LOCUS
La manipolazione genetica del locus β-globin e i conseguenti effetti sulla trascrizione, la sensibilità alla DNasi, l’acetilazione degli istoni, ecc, hanno portato allo sviluppo di due modelli principali per spiegare come questo complesso locus è regolato (per le recensioni, vedi Bulger e Groudine, 1999; Engel e Tanimoto, 2000; Fraser e Grosveld, 1998; Orkin, 1995). Questi modelli si concentrano su come l’LCR e le sue regioni laterali funzionano per regolare l’espressione e l’apertura del locus.
Il modello di looping, o competitivo, sostiene che l’elemento di delezione ispanico (contenente l’LCR) funziona contattando direttamente il promotore del gene all’interno del locus della β-globina che deve essere espresso. È stato dimostrato che l’iniziazione della trascrizione avviene in un solo promotore in qualsiasi momento specifico in una data cellula (Gribnau et al., 1998). Questo modello spiega che l’iniziazione del singolo promotore è il risultato della competizione tra i promotori per il contatto con l’LCR. Tale contatto diretto richiederebbe ovviamente un looping della cromatina intermedia, ma finora non ci sono prove dirette di tale looping. I transgeni contenenti l’LCR e un singolo gene globinico umano fetale (γ) o adulto (β) hanno espresso i geni durante lo sviluppo senza alcuna specificità di sviluppo; tuttavia, i transgeni contenenti l’LCR ed entrambi i geni hanno ripristinato la normale espressione di sviluppo, indicando che la competizione genica è importante per l’espressione correttamente regolata (Behringer et al., 1990; Enver et al., 1990). L’analisi dei transgeni contenenti una copia supplementare del gene della β-globina e del promotore ha sostenuto conclusioni simili. Quando la copia extra è stata posta vicino all’LCR (sostituendo il gene embrionale della ∊-globina), è stata espressa da 10 a 100 volte più efficientemente della copia del gene della β-globina che risiedeva nella sua posizione normale molto più a valle nel transgene. La trascrizione della copia extra è stata rilevata in una fase iniziale dello sviluppo, quando solo i geni globinici embrionali sono normalmente espressi. Quando il gene della β-globina extra è stato inserito appena a monte della copia normale, l’espressione delle due copie era approssimativamente equivalente. È importante notare che il livello totale di trascrizione del gene transgenico della β-globina è rimasto costante indipendentemente dalla posizione della copia extra, ed era approssimativamente uguale alla quantità di trascrizione derivata dal gene endogeno della β-globina (Dillon et al., 1997). L’inversione del cluster genico della β-globina rispetto all’LCR in un costrutto transgenico ha portato a gravi perturbazioni dell’espressione genica. La β-globina era espressa in tutti gli stadi di sviluppo, mentre il gene embrionale (∊) non era espresso affatto. La trascrizione dei due geni della γ-globina umana era anche ridotta, presumibilmente a causa della competizione con i geni della globina adulta per l’LCR. Nel locus wild-type, i livelli di trascrizione dei due geni della γ-globina sono diversi. Nel transgene invertito del cluster di geni della β-globina, i livelli di espressione di questi due geni sono stati invertiti, indicando una competizione (Tanimoto et al., 1999). Questi risultati sostengono che la vicinanza all’LCR è un importante determinante della trascrizione genica nel locus della β-globina.
Il modello di collegamento propone che il contatto diretto tra gli elementi regolatori non deve avvenire. La regione di regolazione della delezione ispanica e altri elementi di cromatina sconosciuti sono proposti per servire come piattaforme per la propagazione di strutture di cromatina aperta in tutto il locus. La cromatina verrebbe aperta e mantenuta in questa configurazione da complessi proteici che si estendono linearmente lungo il DNA. Tali complessi collegherebbero quindi l’LCR con i promotori. I promotori genici distinti servirebbero quindi a reclutare fattori di sviluppo e specifici del gene per l’espressione dei singoli geni. Analisi di transgeni contenenti l’LCR umano e singoli geni come il gene della globina embrionale (∊) e i geni della globina fetale (γ) hanno dimostrato che l’espressione corretta dello sviluppo di questi geni avviene in assenza di qualsiasi altro gene della globina (Dillon e Grosveld, 1991; Lloyd et al., 1992; Shih et al., 1990). Questi dati sembrano essere in conflitto con altri studi (Behringer et al., 1990; Enver et al., 1990). Presumibilmente, le differenze nei costrutti transgenici, e quindi in esattamente quali elementi regolatori cis-acting sono stati inclusi, spiegano le discrepanze. La competizione può essere spiegata dal modello di collegamento, per esempio invocando elementi di confine che impediscono la propagazione dell’accessibilità. I promotori del gene della globina sono stati proposti per agire in questa funzione e prevenire l’apertura del locus a valle (Bulger e Groudine, 1999).
Entrambi i modelli, o una loro combinazione, potrebbero spiegare la modulazione della struttura della cromatina che è alla base del controllo cellulare del riarrangiamento del gene del recettore dell’antigene. Il modello di looping fornisce un meccanismo attraente per un elemento cis-acting per influenzare elementi distanti senza richiedere che perturbi la struttura della cromatina del DNA che interviene. Per esempio, un’interazione diretta tra l’enhancer intronico IgH e un promotore VH potrebbe aprire selettivamente la struttura della cromatina che circonda la RSS di questo segmento del gene V e portare la RSS in prossimità del segmento del gene DJ. Il modello di collegamento fornisce un mezzo attraente attraverso il quale le alterazioni strutturali della cromatina possono essere propagate da un elemento fino a comprendere un intero dominio. Per esempio, l’accessibilità del locus TCRβ potrebbe iniziare dall’enhancer e spostarsi a monte attraverso i segmenti del gene D fino ai segmenti del gene V, permettendo un progressivo accesso alla RSS.