Approcci metodologici
La genetica delle CAVD è stata storicamente collegata alla FC fin dal 1968 quando Kaplan et al. dimostrarono che quasi tutti gli uomini con FC hanno un’azoospermia ostruttiva (OA) dovuta alla CBAVD (Kaplan et al. 1968). Il concetto che forme isolate di CBAVD e fibrosi cistica sono legate allo stesso gene fu confermato poco dopo l’identificazione del gene CFTR nel 1989 (Dumur et al. 1990; Anguiano et al. 1992). Tuttavia, fu presto notato che il 20-40% dei casi di CBAVD non erano legati a mutazioni CFTR, suggerendo la possibilità di eterogeneità genetica (Culard et al. 1994; Chillón et al. 1995). Tuttavia, per 25 anni, la genetica della CAVD è rimasta limitata al CFTR. Il fatto è che lo studio del determinismo genetico dell’infertilità umana è stato a lungo limitato da specifici vincoli metodologici, con i tradizionali approcci basati sulla famiglia tramite analisi di linkage spesso inapplicabili, in particolare nel contesto dell’infertilità maschile a causa di barriere psicosociali e culturali. Pertanto, fino a poco tempo fa, i marcatori genetici comunemente utilizzati nella pratica clinica per esplorare un’azoospermia non ostruttiva (NOA) erano limitati alle anomalie cromosomiche come la sindrome di Klinefelter e le microdelezioni del cromosoma Y (Krausz 2011). Tuttavia, nell’ultimo decennio, l’avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha permesso lo sviluppo di potenti approcci basati sul sequenziamento dell’intero esoma (WES) o del genoma intero (WGS) e sull’analisi del trascrittoma intero. Circa 20 geni coinvolti in forme monogeniche di NOA sono stati recentemente identificati (rivisti da Ghieh et al. 2019). Per quasi tutti questi geni, mutazioni causali, tutte recessive, sono state identificate in famiglie consanguinee (Yang et al. 2018). D’altra parte, a nostra conoscenza, casi familiari eccezionali di OA non sono mai stati osservati in un contesto di consanguineità, un limite che spiega in parte perché, nonostante le strutture dei nuovi approcci genomici, il numero di nuovi geni identificati nella CAVD è stato molto inferiore. Tuttavia, negli ultimi anni, due grandi approcci complementari hanno contribuito all’identificazione di geni candidati; quelli basati sullo studio dei genomi individuali e quelli basati sull’analisi del trascrittoma delle cellule del dotto seminale, principalmente dell’epididimo. Il primo ha portato a stabilire correlazioni rilevanti tra iCBAVD e mutazioni puntiformi del gene ADGRG2 identificate dall’analisi WES (Patat et al. 2016; Khan et al. 2018), così come variazioni del numero di copie dei geni PANK2 e SLC9A3 identificate dall’analisi di ibridazione genomica comparativa basata su array (array-CGH) (Lee et al. 2009). Gli approcci trascrittomici che utilizzano il cDNA microarray o il sequenziamento dell’RNA sono riusciti a individuare molti geni candidati funzionali, in particolare i geni la cui espressione è limitata alle cellule del dotto seminale o il cui profilo di espressione è specifico di alcune parti del dotto seminale (Browne et al. 2016). Diversi di questi geni candidati come ADGRG2 e SLC9A3 sono stati convalidati in topi knockout e la loro fisiologia esplorata in questo modello animale (Davies et al. 2004; Wang et al. 2017). Recentemente, un approccio multiomico integrativo che combina WGS, analisi del metiloma del DNA intero e sequenziamento dell’RNA ha portato all’identificazione di due nuovi geni candidati, SCNN1B e CA12, in un individuo con iCBAVD (Shen et al. 2019). Tuttavia, nonostante questi progressi, non esiste ancora una diagnosi genetica per almeno un quarto delle CAVD, la maggior parte delle quali sono CUAVD. Finora, l’ipotesi che queste forme inspiegabili di CAVD non siano il risultato di semplici variazioni genetiche è stata poco esplorata. È prevedibile che in futuro i nuovi metodi di studio dell’epigenoma e la potenza degli strumenti bioinformatici permetteranno di precisare il ruolo della regolazione epigenomica nell’insorgenza di queste CAVD isolate. Tuttavia, questo approccio avrà tanto più successo quanto più sarà applicato a coorti di dimensioni adeguate composte da pazienti CAVD perfettamente fenotipizzati di origine etnica omogenea.
Geni implicati nella CAVD
Mentre il determinismo genetico delle NOA è caratterizzato da una significativa eterogeneità genetica con più di 30 geni identificati (SPGF ), quello delle OA è limitato a pochissimi geni (Ghieh et al. 2019). Pertanto, è stabilito che circa tre quarti dei casi caucasici di CAVD sono legati ad anomalie in due geni: CFTR per la maggioranza dei casi e ADGRG2 per una minoranza (Patat et al. 2016). Altri geni come SLC9A3 potrebbero essere coinvolti in alcune iCBAVD ma anche fattori epigenetici o ambientali con ruoli fisiopatologici molto diversi.
CFTR (MIM#602421) è stato identificato per clonazione posizionale nel 1989 da Riordan et al. (1989) mettendo fine a diversi anni di ricerca competitiva per scoprire l’unico gene responsabile della FC. Circa la metà dei pazienti FC di discendenza nordeuropea sono omozigoti per una delezione di tre coppie di basi (NM_000493.3:c.1521_1523del), con conseguente perdita della fenilalanina 508 (NP_000483.3:p.Phe508del, nome ereditato: F508del). In media, 1 su 40 individui nella popolazione caucasica è eterozigote per la mutazione p.Phe508del, rendendola una delle mutazioni patogene umane più frequenti (Kerem et al. 1989). CFTR, che copre 250 kb sul braccio lungo del cromosoma 7 in 7q31.2, contiene 27 esoni codificanti e produce diversi trascritti, solo uno dei quali, un mRNA di 6,1 kb, codifica per una proteina funzionale di 1.480 aminoacidi chiamata CF transmembrane conductance regulator (CFTR). CFTR è una proteina transmembrana glicosilata espressa nella membrana apicale di molte cellule epiteliali, dove funziona principalmente come un canale del cloruro regolato da cAMP. Molti studi hanno dimostrato che CFTR è coinvolta nella regolazione di diversi trasportatori di ioni tra cui il canale del sodio (ENacs), scambiatori di cloruro/bicarbonato, scambiatori di protoni (Na+/H+), e canali dell’acqua (aquaporins). Pertanto, i processi fisiologici dipendenti da CFTR giocano un ruolo cruciale nel mantenere l’omeostasi di ioni, pH e acqua nei fluidi epiteliali secretori (Choi et al. 2001). In 3 decenni, sono state riportate più di 2000 mutazioni in CFTR (https://www.genet.sickkids.on.ca/), ma meno di un quarto sono classificate come patogene (https://www.cftr2.org/) sulla base di correlazioni con CF o altre condizioni che spesso hanno una prognosi meno grave, limitate a un singolo organo come i bronchi (bronchiectasia disseminata, MIM#211400), il pancreas (pancreatite cronica MIM#167800) o i deferenti (assenza bilaterale congenita dei deferenti, MIM#277180). Queste condizioni che non soddisfano tutti i criteri della fibrosi cistica ma che sono correlate alla disfunzione CFTR sono state raggruppate sotto il termine generico CFTR-RD (Bombieri et al. 2011). Tutte le regioni di CFTR possono essere interessate da mutazioni che causano la malattia, comprese le regioni promotrici e le regioni introniche profonde (Feng et al. 2019; Bergougnoux et al. 2019). A seconda dei loro effetti sulla biogenesi e sulle funzioni di CFTR, gli alleli patogeni sono classificati in due categorie principali: Varianti CF-causanti (dette anche “severe”) che, allo stato omozigote, sono sempre associate alla FC e varianti non CF-causanti che non sono mai state osservate in pazienti FC e che sono, quindi, erroneamente chiamate alleli “mild”. Una minoranza di alleli che causano FC sono stati osservati in forme cliniche variabili di fibrosi cistica più o meno grave, in cui la funzione pancreatica è spesso conservata. La patogenicità di questi alleli chiamati VCC (per varianti di diversa conseguenza clinica) potrebbe dipendere da fattori genetici raramente conosciuti come l’associazione cis con alleli complessi o fattori non genetici sconosciuti. A differenza delle varianti che causano la FC, le varianti che non causano la FC causano una disfunzione CFTR incompleta. A seconda dell’organo, se l’attività residua della CFTR è troppo bassa per mantenere l’omeostasi, può comparire una CFTR-RD. Pertanto, i soggetti con CFTR-RD sono generalmente portatori di una variante non causante CFTR, spesso combinata in trans con una variante causante CF o, più raramente, con un’altra variante non causante CFTR. Questi alleli sono a volte indicati come alleli CFTR-RD-causanti.
ADGRG2 (MIM#300372) situato in Xp22.13 è composto da 29 esoni che producono circa dieci trascritti, il più lungo dei quali ha un open-reading frame di 3,1 kb (copre gli esoni 3-29) che codifica per il recettore G di adesione accoppiato alla proteina G2 (ADGRG2). Il suo cDNA è stato inizialmente clonato nel 1997 da Osterhoff et al. (1997) dopo uno screening differenziale di una libreria di cDNA di cellule epididimali umane in cui questo clone, chiamato HE6 (per human epididymis-specific protein 6) era ampiamente rappresentato. Con una sequenza dedotta di 1017 aminoacidi e i suoi sette domini transmembrana altamente conservati, la proteina HE6 appartiene alla superfamiglia dei recettori accoppiati alle proteine G (GPCR), nella quale è stata originariamente indicata come GPR64. La struttura e la proprietà autocatalitica della parte extracellulare di HE6/GPCR64 hanno portato alla sua classificazione finale nella sottofamiglia G dei GPCR di adesione (aGPCR) (Hamann et al. 2015). ADGRG2 è una proteina altamente glicosilata quasi esclusivamente ed altamente espressa nella parte prossimale dei dotti seminali maschili (https://proteinatlas.org), precisamente nell’epitelio dei dotti efferenti e nella parte iniziale del dotto epididimale. L’immunolabeling di ADGRG2 è particolarmente forte nelle stereociglia delle cellule epididimali principali e nei microvilli delle cellule non ciliate dei dotti efferenti dove viene riassorbito il 90% del liquido secreto dal testicolo (Kirchhoff et al. 2008; Patat et al. 2016). Il coinvolgimento di ADGRG2 in questo processo è stato inizialmente suggerito da HE6/GPR64 knockout (interruzione mirata) nei topi, che, nei maschi emizigoti, si traduce in un accumulo di fluido nel testicolo e stasi di sperma nei dotti efferenti che porta ad un fenotipo di infertilità ostruttiva (Davies et al. 2004). ADGRG2 è un recettore orfano con ligandi naturali sconosciuti e vie di segnalazione parzialmente chiarite. Come la maggior parte degli aGPCR, l’ADGRG2 maturo è un eterodimero risultante dalla scissione di un dominio altamente conservato contenente il sito di proteolisi GPCR (GPS) in un frammento extracellulare N-terminale (NTF) non covalentemente attaccato ad un grande frammento C-terminale (CTF) ancorato nella membrana cellulare (Obermann et al. 2003). Come queste due subunità cooperino sotto l’azione di agonisti endogeni per mediare i segnali e se abbiano funzioni specifiche separate sono domande che rimangono senza risposta. Tuttavia, è stato dimostrato che l’estremità extracellulare della CTF risultante dalla scissione porta una sequenza Stachel con proprietà agonistiche (Demberg et al. 2015). Inoltre, recenti dati sperimentali ottenuti in modelli in vitro e in vivo mostrano che attraverso la segnalazione mediata dalle proteine Gs e Gq, ADGRG2, è in grado di modulare rispettivamente l’attività di c-AMP e PKC (Demberg et al. 2017; Balenga et al. 2016; Zhang et al. 2018).
Mutazioni causali nella CAVD, tipo ed epidemiologia
Mutazioni CFTR
Meno di un anno dopo l’identificazione del gene CFTR (Riordan et al. 1989), Dumur et al. osservarono una frequenza anormalmente alta della mutazione p.Phe508del in una piccola serie di uomini infertili con iCBAVD (Dumur et al. 1990). Questa scoperta, che ha sostenuto l’ipotesi che l’iCBAVD potrebbe essere una forma monosintomatica di fibrosi cistica, ha avuto una conseguenza medica importante. In seguito, tutti gli uomini con iCBAVD che si sottoponevano a tecnologie di riproduzione medicalmente assistita (ART) tramite prelievo chirurgico di sperma e iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI) dovevano essere considerati a maggior rischio di avere un figlio con fibrosi cistica (Anguiano et al. 1992). Successivamente, Chillon et al. hanno confermato che, a differenza dei pazienti affetti da fibrosi cistica che portano solo mutazioni che causano la fibrosi cistica responsabili di una perdita completa della funzione del canale del cloruro CFTR, i pazienti iCBAVD portano almeno una copia di CFTR con una mutazione cosiddetta “lieve”, perché correlata a un’attività CFTR ridotta o parziale del 3-8% (Chillón et al. 1995). Questa situazione è ben illustrata da una variante di un polimorfismo di politimidina (Tn) nell’introne 9 (NM_000493.3:c.1210-12T), il cosiddetto allele IVS8-5T (allele 5T) la cui frequenza è da quattro a cinque volte superiore nei soggetti iCBAVD (rivista da De Sousa et al. 2018). Questo allele 5T ha un effetto deleterio sullo splicing che promuove lo skipping dell’esone 10 portando a una riduzione significativa del normale mRNA CFTR (Chu et al. 1993). Fino a un terzo dei soggetti iCBAVD di origine europea sono eterozigoti composti portatori di una mutazione che causa CF, la più frequente è F508del, e l’allele 5 T in trans (Chillón et al. 1995). Tuttavia, poiché questo genotipo è stato osservato in padri fertili che hanno avuto un figlio con FC, Cuppens et al. hanno dimostrato che la penetranza di questo allele 5 T rispetto allo skipping dell’esone 10 dipende principalmente dalla dimensione di una sequenza polimorfica polyTG (NM_000493.3:c.1210-34TG) a monte della sequenza polyT (Cuppens et al. 1998). Così, mentre la polivariante TG(11)5T (NM_000493.3:c.1210-34TGT) si trova nella stragrande maggioranza dei soggetti sani, è la combinazione TG(12)5T che si trova più spesso nei soggetti iCBAVD, mentre l’allele molto più raro TG(13)5T è sempre identificato nei soggetti iCBAVD (Groman et al. 2004). Negli ultimi 20 anni, numerosi studi hanno permesso di caratterizzare lo spettro delle mutazioni CFTR nei soggetti CBAVD specificando la loro frequenza in base all’etnia e alle origini geografiche (rivisto da Yu et al. 2012). Mentre gli stessi tipi di mutazioni gravi, compresi grandi riarrangiamenti di CFTR (Taulan et al. 2007), si trovano sia nei soggetti con CF-CBAVD che in quelli con iCBAVD, lo spettro mutazionale di CFTR nella iCBAVD è radicalmente diverso in quanto ci sono molte mutazioni non causanti CF, la maggior parte delle quali può essere associata ad altri fenotipi CFTR-RD come pancreatopatie, bronchiectasie disseminate e disturbi sinonasali (Bombieri et al. 2011). Queste mutazioni “lievi” includono principalmente varianti introniche che influenzano lo splicing, la più frequente delle quali è l’allele 5T, e numerose mutazioni missenso che influenzano il funzionamento del canale del cloruro, la più frequente nei caucasici è la mutazione p.Arg117His (R117H) (Casals et al. 2000; Claustres et al. 2000). La maggior parte di queste mutazioni non causanti FC non vengono rilevate dai pannelli di routine progettati per la popolazione FC classica, che mirano principalmente alle mutazioni più frequenti che causano FC (numerosi kit commerciali disponibili). Ecco perché, per la diagnosi molecolare delle CBAVD e di altre CFTR-RD, si raccomanda di scegliere un test CFTR che includa le due principali varianti “lievi”, R117H, e l’allele 5T come test di prima linea (vedi sotto il capitolo “Implicazioni per la pratica clinica…”). Se questo è inconcludente, dovrebbe essere eseguita una caratterizzazione completa del CFTR, includendo almeno il sequenziamento di tutti gli esoni e delle regioni introniche adiacenti, nonché la ricerca di grandi riarrangiamenti. I metodi di diagnosi molecolare basati sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono sempre più utilizzati per l’individuazione non solo di mutazioni puntiformi ma anche di grandi delezioni o duplicazioni. Questi nuovi metodi di scansione genica che possono essere applicati a un pannello permettono di evitare il laborioso sequenziamento Sanger e le tecniche di PCR semiquantitative (MLPA, QMPSF, qPCR, ecc.) eseguite esone per esone.
Le frequenze delle mutazioni CFTR nei pazienti CAVD differiscono da studio a studio, probabilmente a causa di un bias di reclutamento, delle dimensioni della coorte e dell’eterogeneità dei metodi di genotipizzazione, con molti soggetti che hanno avuto un’analisi parziale di CFTR. Tuttavia, è chiaro che la frequenza di alcuni alleli è molto diversa nei pazienti CAVD caucasici e in quelli provenienti da paesi non caucasici in cui la fibrosi cistica è molto più infrequente. Questo è in particolare il caso della mutazione F508del, che è eccezionalmente rilevata nei pazienti cinesi iCBAVD, mentre fino a un terzo dei pazienti iCBAVD nel nord Europa sono portatori. D’altra parte, i pazienti iCBAVD di origine asiatica sono più spesso portatori dell’allele 5T rispetto ai caucasici (Tabella 1), mentre la frequenza di questo allele nella popolazione generale varia poco nel mondo (5%). Nel complesso, la meta-analisi dei dati pubblicati da Yu et al (2012) indica che circa l’80% dei pazienti caucasici iCBAVD sono portatori di almeno una mutazione in CFTR. Lo studio più esaustivo possibile lascia il 6% dei soggetti senza alcuna mutazione rilevata (Ratbi et al. 2007). Considerando che alcuni di questi pazienti possono essere eterozigoti semplici (3% nella popolazione caucasica) e che altri sono portatori di varianti di significato sconosciuto possibilmente neutre (non causano CF o CFTR-RD), si può supporre che il CFTR sia implicato nel 75-80% dei casi di iCBAVD. Pertanto, per circa un quarto dei pazienti iCBAVD, la responsabilità della CFTR non può essere definitivamente provata, mentre per i pazienti FC, i due alleli mutati possono essere caratterizzati nel 99% dei casi (Tabella 1). Per le CUAVD, il 30-50% dei soggetti è portatore di almeno una mutazione di CFTR dopo una scansione genica completa, il che significa che più della metà delle CUAVD non sono correlate a CFTR (Schlegel et al. 1996; Casals et al. 2000; Cai et al. 2019; Mieusset et al. 2020). La presenza di un’anomalia renale è molto significativamente più frequente nei pazienti CAVD in cui è stata rilevata una sola o nessuna anomalia CFTR (Augarten et al. 1994; Schwarzer & Schwarz 2012). Pertanto, si può ipotizzare che la differenza nel tasso di mancata rilevazione di mutazioni CFTR tra CBAVD (20%) e CUAVD (50%) sia almeno parzialmente correlata alla differenza nella frequenza di agenesia renale unilaterale osservata nei due gruppi, 5% vs 25%, rispettivamente (Weiske et al. 2000; McCallum et al. 2001; Kolettis e Sandlow 2002; Yang et al. 2015).
mutazioni ADGRG2
Nel 2016, dopo aver accuratamente selezionato, da una grande serie retrospettiva di 379 uomini iCBAVD di origine europea, una coorte di 26 individui che non avevano né mutazioni CFTR né anomalie renali associate, Patat et al. hanno identificato tre mutazioni emizigoti troncanti nel gene X-linked ADGRG2 (MIM#300572.0001_3) in quattro soggetti (Patat et al. 2016). L’accertamento del ruolo causale di queste mutazioni nel fenotipo iCBAVD si è basato su una serie di argomenti: (i) i topi maschi ADGRG2 knockout (KO) sviluppano OA senza altre anomalie significative (Davies et al. 2004), (ii) l’esame istologico di una biopsia epididimale di uno dei quattro individui ha mostrato una mancanza di espressione di ADGRG2 nell’epitelio dei dotti efferenti che erano anormalmente dilatati, (iii) una delle mutazioni tronche è stata identificata in due individui sterili legati da un legame materno (un nipote e uno zio materno). Da allora, tre pubblicazioni (Yang et al. 2017; Yuan et al. 2019; Khan et al. 2018) hanno riportato l’identificazione di cinque nuove varianti rare di ADGRG2 in sei pazienti iCBAVD di origine asiatica senza mutazioni CFTR patogene: due mutazioni nonsense classificate come patogene, di cui una in due fratelli infertili di origine pakistana (Khan et al. 2018) e tre mutazioni missense, di cui una che colpisce la regione GPS che è stata classificata come patogena (Yang et al. 2017). Questi sei pazienti non avevano anomalie renali. Recentemente, Pagin et al. hanno anche riportato sei nuove mutazioni troncanti ADGRG2 in una coorte di 53 pazienti francesi CAVD che portavano 0 o solo 1 allele difettoso CFTR. In questo studio, gli autori non sono riusciti a ottenere prove convincenti per sostenere l’ipotesi di un’eredità digenica che coinvolge ADGRG2 e CFTR. Hanno concluso che l’inattivazione di ADGRG2 è responsabile di circa il 20% delle CAVD non correlate alla disfunzione CFTR. Inoltre, non hanno trovato nessun caso di rene solitario tra gli 8 pazienti ADGRG2 mutati della loro coorte (Pagin et al. 2019). È interessante notare che nessuna mutazione ADGRG2 o CFTR è stata identificata da Patat et al. in una coorte di 28 pazienti iCBAVD con URA (dati personali).
Altre mutazioni
A nostra conoscenza, oltre a CFTR e ADGRG2, le uniche altre mutazioni che hanno sollevato la questione di una possibile correlazione con iCBAVD sono CNV che coinvolgono i geni PANK2 e SLC9A3. Fino ad oggi, queste CNV sono state descritte solo in pazienti iCBAVD di Taiwan. Come in altre popolazioni asiatiche, la CF e la CFTR-RD sono raramente osservate a Taiwan e, a parte l’allele IVS8-5T la cui frequenza è significativamente aumentata negli uomini taiwanesi iCBAVD infertili, sono stati caratterizzati pochissimi alleli CFTR patogeni (Chiang et al. 2009). Indagando i CNV tramite array-CGH e PCR quantitativa in tempo reale in una piccola coorte di individui taiwanesi iCBAVD, il team di HS Chiang ha identificato in un singolo individuo la perdita omozigote del gene pantotenato chinasi 2 (PANK2) (Lee et al. 2009) e in 11 di 29 soggetti, la perdita di una copia del gene solute carrier family 9 isoform 3 (SLC9A3) (Wu et al. 2018; rivista da Chiang et al. 2019). PANK2 è stato selezionato come un potenziale gene legato alla riproduzione, perché il topo KO aveva azoospermia (Kuo et al. 2005). Tuttavia, era un NOA e questa condizione non è osservata negli esseri umani affetti da neurodegenerazione associata a pantotenato chinasi (MIM#234200). Ad oggi, non sono stati riportati altri casi di CBAVD legati ad una delezione di PANK2. Pertanto, la correlazione rimane incerta e l’osservazione aneddotica. D’altra parte, i dati sperimentali ottenuti dallo stesso team sul coinvolgimento di SLC9A3 nel fenotipo CBAVD sono sostanziali e più convincenti. Infatti, questi autori hanno dimostrato che il topo maschio adulto SLC9A3-/- sviluppa azoospermia ostruttiva a causa di anomalie strutturali e funzionali dei dotti efferenti con atrofia progressiva a lungo termine dei vasi deferenti e delle vescicole seminali (Wu et al. 2019; Chiang et al. 2019). Notevolmente, gli autori hanno osservato una drastica diminuzione di CFTR nell’epididimo e nei vasi deferenti in questi topi SLC9A3-KO suggerendo ruoli interdipendenti dei due geni nel determinismo di iCBAVD (Wang et al. 2017). Tuttavia, nonostante queste osservazioni molto illuminanti sul ruolo di SLC9A3 nella fisiologia del tratto riproduttivo dei topi maschi, la relazione tra la perdita di una copia di questo gene e iCBAVD nell’uomo è ancora poco compresa. Considerando che le mutazioni recessive di SLC9A3 causano una grave forma di diarrea congenita da secrezione di sodio (congenital secretory sodium diarrhea, MIM#616868) e che le mutazioni loss-of-function, compresa una delezione completa di SLC9A3, hanno dimostrato di essere trasmesse da padri eterozigoti (Janecke et al. 2015), la CBAVD dei pazienti taiwanesi non può essere spiegata dalla sola aploinsufficienza SLC9A3. Inoltre, Wu et al. hanno riportato nel suo studio che tra i 29 pazienti taiwanesi con iCBAVD, 6 (20,7%) sono stati trovati omozigoti o eterozigoti composti per gli alleli CFTR TG(12)5T o TG(13)5T, uno stato genotipico che potrebbe essere sufficiente da solo a causare iCBAVD. Di questi sei individui, due avevano solo una copia di SLC9A3. Da questa stessa coorte, altri 12 pazienti iCBAVD erano eterozigoti per l’allele TG(12)5T o TG(13)5T, la metà dei quali aveva anche una delezione di SLC9A3 (Wu et al. 2019). La possibilità di digenismo che coinvolge varianti CFTR come l’allele 5T è ancora altamente speculativa. Va notato che nessuno di questi 29 pazienti taiwanesi CBAVD aveva un’assenza renale unilaterale.