Frontiers in Oncology

Introduzione

È noto che l’infezione persistente da papillomavirus umano ad alto rischio (hr-HPV) è una causa necessaria per il cancro cervicale e le lesioni precancerose (1, 2). Con un’eziologia rivelata, il cancro cervicale è altamente prevenibile (3, 4). I paesi sviluppati hanno iniziato a utilizzare il test dell’hr-HPV nello screening primario del cancro cervicale, da solo o in co-test con la citologia (5-8). L’evidenza dimostra che i programmi di screening basati sull’HPV forniscono una maggiore protezione contro il pre-cancro cervicale e il cancro rispetto ad altri metodi di screening tradizionali, come la citologia (9-11). Tuttavia, poiché la maggior parte delle infezioni da HPV potrebbero essere eliminate spontaneamente, il test HPV identifica numerose infezioni che non progrediranno verso il pre-cancro cervicale o il cancro, soprattutto nelle giovani donne (12). Pertanto, il test HPV DNA non è raccomandato per lo screening delle donne sotto i 30 anni. Inoltre, le pazienti HPV-positive riferite per le procedure successive possono subire interventi invasivi non necessari.

In Cina, ci sono stati 98.900 nuovi casi e 30.500 morti per cancro cervicale nel 2015 (13). Per frenare la tendenza all’aumento di questa neoplasia, il governo cinese ha fornito un programma di screening gratuito del cancro cervicale a livello nazionale per le donne che vivono nelle zone rurali dal 2009, utilizzando VIA/VILI, Papanicolaou (Pap) test o HPV test (nei siti pilota), in base ai livelli di sviluppo economico e tecnologico (14). Tuttavia, a causa della natura di questi metodi di screening, l’accuratezza diagnostica deve essere migliorata. Inoltre, considerando la vasta popolazione cinese, si dovrebbe valutare un nuovo strumento di screening con un equilibrio tra sensibilità e specificità.

I marcatori molecolari specifici per il cancro cervicale forniscono una combinazione di alta sensibilità e alta specificità per rilevare il pre-cancro cervicale. La maggior parte di questi marcatori sono stati identificati sulla base del meccanismo di carcinogenesi legato all’HPV. Il test HPV RNA si basa sul rilevamento dell’mRNA di HR-HPV E6 ed E7. Il potenziale oncogeno dell’infezione da HPV dipende dalla produzione di oncoproteine virali E6/E7. Quindi, il rilevamento dei trascritti di mRNA E6/E7 fornisce la possibilità di un test specifico per rilevare le lesioni precancerose.

In questo studio, abbiamo valutato la performance clinica del test HPV E6/E7 mRNA per rilevare la neoplasia intraepiteliale cervicale di alto grado (CIN) e il cancro tra le donne cinesi.

Materiali e metodi

Partecipanti e procedure

Questo studio basato sull’ospedale è stato condotto da aprile a dicembre 2017 nella provincia di Henan, Cina. Sono state invitate le donne che hanno visitato il dipartimento di ginecologia del Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) per la colposcopia. I criteri di inclusione erano i seguenti: (1) donne di età compresa tra 25 e 64 anni; (2) nessuna storia di cancro cervicale o isterectomia; (3) nessun sintomo clinico di gravidanza o 8 settimane dopo l’interruzione della gravidanza; e (4) comprendere le procedure dello studio, e partecipare volontariamente. Lo studio è stato approvato dall’Institutional Review Board (IRB) dell’Henan Cancer Hospital (HCH). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni partecipante.

Le cellule cervicali esfoliate sono state ottenute da donne durante la visita ginecologica. Il campione è stato conservato in 20 ml di mezzo di trasporto PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, Stati Uniti) e conservato a 4°C. Poi, l’esame colposcopico è stato eseguito da un ginecologo. Le donne con risultati anormali della colposcopia sono state sottoposte a biopsia mirata alla lesione. Se l’esame colposcopico non era soddisfacente (la giunzione squamocolonnare non era completamente visibile), è stato eseguito un curettage endocervicale (ECC). I campioni di cellule cervicali esfoliate sono stati trasportati al Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS). I campioni sono stati divisi in due porzioni: una miscela di cellule da 1,5 ml in una provetta EP per il test HR-HPV DNA e il test HPV E6/E7 mRNA. Il preservativo residuo con cellule esfoliate è stato utilizzato per il test citologico ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Stati Uniti). Il sistema di refertazione Bethesda è stato utilizzato per la citologia da un citologo senior (15).

Saggio del DNA HR-HPV

I campioni di miscela cellulare da 400 μl da provette EP da 1,5 ml sono stati utilizzati per il rilevamento del DNA di 14 tipi di hr-HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68) mediante il saggio Cobas 4800 HPV (Roche, Basel, SUI). Ha riportato il risultato aggregato dei 14 hrHPV, e il risultato separato per HPV 16 e 18, simultaneamente (16). Cobas 4800 era un test basato sulla PCR per HPV DNA con amplificazione per ibridazione dell’acido nucleico secondo le istruzioni del produttore. I controlli di qualità negativi e positivi sono stati impostati in ogni test. Se il valore ct era superiore a 40, il risultato era considerato negativo. Altrimenti, il risultato era positivo. I risultati positivi includevano tre tipi: HPV 16, HPV 18, e HPV altri (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68).

HPV E6/E7 mRNA Testing

Sono stati utilizzati campioni di un ml da provette EP da 1,5 ml per il rilevamento dell’mRNA virale E6/E7 dei tipi 14 hr-HPV nel test APTIMA HPV aggregato (Hologic Inc, Marlborough, MA, Stati Uniti), secondo le istruzioni del produttore (17). Si trattava di un test in tre fasi, compresa l’estrazione dell’mRNA, l’amplificazione e il rilevamento del prodotto amplificato. Se il numero di copie era maggiore o uguale a 1,0, il risultato è stato considerato positivo. Altrimenti, il risultato era negativo.

Diagnosi istopatologica

I tessuti della biopsia e dell’ECC sono stati inviati alla SAHZU per la diagnosi istopatologica secondo il sistema di segnalazione della neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN). Poi gli istopatologi dell’HCH hanno esaminato tutti i vetrini. Qualsiasi diagnosi patologica incoerente è stata inviata al CICAMS per l’aggiudicazione. La diagnosi finale per ogni donna era basata sulla lettura peggiore dalla revisione del panel. Tutto il processo di rilevazione e diagnosi era in cieco.

Analisi statistica

La diagnosi istopatologica finale è stata usata come gold standard. Le donne con diagnosi TCT di lesione intraepiteliale squamosa di basso grado (LSIL) o peggio (LSIL +) sono state considerate positive alla citologia a base liquida (LBC). I risultati dell’HPV DNA sono stati stratificati in base ai tipi di HPV: HPV16/18 (cioè, HPV16 e/o HPV18 positivi), HPV-altri (cioè, uno qualsiasi dei 12 tipi di HPV positivi esclusi HPV16 e HPV18), e HPV-totale (cioè, uno qualsiasi dei 14 tipi di HPV positivi). Sono state calcolate le stime assolute e gli intervalli confidenziali al 95% (95%CI) dei tassi di positività, sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV). Le differenze nelle espressioni dell’mRNA dell’HPV nei diversi gruppi di HPV sono state calcolate usando il test del chi-quadrato o il test esatto di Fisher. Il test di McNemar è stato utilizzato per identificare le differenze di sensibilità e specificità. Il livello α è stato fissato a 0,05, e p < 0,05 (due dimensioni) è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

In totale, 537 donne sono state incluse in questa analisi. L’età media era di 43,88 ± 10,97 anni. Le diagnosi di LBC erano: 183 (34,7%) normali, 135 (25,1%) cellule squamose atipiche di significato indeterminato (ASC-US), 22 (4,1%) cellule squamose atipiche non possono escludere HSIL (ASC-H), 7 (1.3%) cellula ghiandolare atipica (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) lesione intraepiteliale squamosa di alto grado (HSIL), 31 (5,8%) carcinomi a cellule squamose (SCC), e 2 (0,4%) adenocarcinoma in situ (AIS). Le diagnosi istopatologiche erano 298 (55,5%) normali, 30 (5,6%) neoplasia cervicale intraepiteliale di grado 1 (CIN1), 48 (8,9%) CIN2, 111 (20,7%) CIN3, 43 (8,0%) SCC, e 7 (1,3%) AIS. L’accordo totale dei due test era del 90,7% (95%CI: 87,9, 92,9) con un valore kappa di 0,81. I tassi di positività dell’mRNA sono stati del 91,7%, 84,6% e 86,4% nelle donne positive all’HPV16/18, all’HPV-altro e all’HPV-totale, rispettivamente. Tutti i tassi di positività all’mRNA erano più alti nelle donne HPV-positive rispetto alle donne HPV-negative nello stesso gruppo di tipo HPV (tutti p < 0,001).

I tassi di positività dell’HPV DNA, mRNA, e LBC aumentavano con la gravità della diagnosi istopatologica, variavano dal 25,5, 19,1, e 11,4% nel normale al 100,0% nel SCC, rispettivamente. I tassi di positività dei tre test nell’AIS erano rispettivamente 85,7, 85,7 e 100,0%. Questi tre test avevano tassi positivi simili in CIN3, SCC e AIS. Ma i tassi di positività dell’mRNA erano relativamente più bassi nelle donne con diagnosi CIN2. I tassi di positività per HPV16 erano i più alti in CIN3, SCC, e AIS rispetto agli altri gruppi di HPV DNA. I tassi di HPV18 positivi erano inferiori al 7% in tutte le lesioni squamose, ma un po’ più alti (28,6%) in AIS (Tabella 2).

Tabella 3 ha mostrato la performance clinica dei tre test nel rilevare le lesioni CIN2+ e CIN3+. Le sensibilità dell’mRNA nel rilevare CIN2+ e CIN3+ erano rispettivamente del 93,8% (95%CI: 89,7-96,4) e del 95,7% (95%CI: 91,3-97,9), che non erano diverse da quelle rilevate dal DNA (95,7% per CIN2+, 96,3% per CIN3+), ma superiori a quelle rilevate dalla LBC (80,4% per CIN2+ e 88,8% per CIN3+). Le specificità dell’mRNA per rilevare CIN2+ (79,0% ) e CIN3+ (70,5% ) erano significativamente più alte di quelle rilevate dal DNA (71,0% per CIN2+, 62,8% per CIN3+) (p < 0,05), ma inferiori a quelle rilevate dalla LBC (84,5% per CIN2+, 79,8% per CIN3+). I PPV per l’mRNA per rilevare CIN2+ e CIN3+ erano 74,0% (95%CI: 68,4-78,9) e 58,1% (95%CI: 52,1-63,9), e i NPV erano 95,2% (95%CI: 92,0-97,2) e 97,4% (95%CI: 94,8-98,8), rispettivamente.

Tabelle 4, 5 hanno mostrato i tassi di positività e la performance clinica dei tre test in diversi gruppi di età. In sintesi, tutti i test hanno mostrato prestazioni migliori per le donne con più di 30 anni rispetto alle donne più giovani. Il test HPV DNA ha avuto la più alta sensibilità, e LBC ha avuto la più alta specificità per rilevare CIN2+ e CIN3+ in donne più giovani di 30 anni.

Discussione

I risultati presentati hanno mostrato che il test mRNA e il capezzolo DNA hanno raggiunto un alto accordo come 90,7%. I tassi di positività dell’HPV DNA, mRNA e LBC sono aumentati con la gravità della diagnosi istopatologica, dal 25,5, 19,1 e 11,4% nel normale al 100,0% nel SCC, rispettivamente. Le sensibilità per l’mRNA nel rilevare CIN2 e CIN3+ erano del 93,8% e 95,7%, che erano simili a quelle rilevate dal DNA (95,7% per CIN2+ e 96,3% per CIN3+). Ma le specificità per l’mRNA (79,0% per CIN2+ e 70,5% per CIN3+) erano significativamente più alte di quelle rilevate dal DNA (71,0% per CIN2+ e 62,8% per CIN3+).

In questo studio, il test HPV E6/E7 mRNA e il test HPV DNA hanno mostrato un elevato accordo. Delle donne HPV 16/18 DNA positive, il 91,7% era positivo anche all’mRNA, il che è simile ad altri studi, che hanno riportato un accordo complessivo di oltre il 90% tra il test APTIMA HPV e i test HPV DNA (17, 18), e tassi di positività costantemente più elevati per il test HPV DNA in diverse popolazioni (19, 20). Abbiamo notato tassi di positività più elevati nelle donne più anziane rispetto a quelle più giovani, il che è leggermente diverso da altri studi (21-23). Questa variazione può essere attribuita al disegno dello studio (cioè, studio basato sull’ospedale), che limita l’estrapolazione dei risultati nella popolazione generale. È interessante notare che il tasso di discordanza era più alto nelle donne di 30 anni o più giovani (25,6% contro 8,6%). Alcuni studi hanno dimostrato un tasso più elevato di clearance spontanea dell’infezione da HPV nelle donne più giovani, il che indicava una minore possibilità di integrazione dell’HPV (24).

Come sappiamo, i test HPV basati sul DNA rilevano la presenza o l’assenza di HPV DNA. Tuttavia, la maggior parte delle infezioni da HPV sono transitorie, cancellate spontaneamente entro 1 anno, che non progredirebbero verso il pre-cancro cervicale o il cancro (25). L’espressione dell’mRNA di E6/E7 si verifica solo nelle cellule attivamente infettate e aumenta durante lo sviluppo e la progressione di CIN (26). Pertanto, il test HPV mRNA dovrebbe essere più specifico nel rilevare lesioni cervicali di alto grado. I nostri dati hanno confermato questa ipotesi. Abbiamo trovato che il test mRNA era sensibile quanto il test DNA, ma più specifico nel rilevare il pre-cancro e il cancro cervicale. Altri ricercatori hanno tratto conclusioni simili sia nello screening primario (20) che nel triage di donne con citologia anormale minore (27). Nel nostro studio, 50 donne avevano risultati discordanti tra il test HPV DNA e mRNA. Tra queste, 34 DNA + /mRNA- contro 8 mRNA + /DNA- sono stati diagnosticati come normali o CIN1; 6 contro 2 sono stati diagnosticati come CIN2 o CIN3; nessuna differenza di test è stata osservata nei tumori. Pertanto, se sostituiamo il test HPV DNA con il test mRNA, 34 donne non sarebbero state indirizzate per una colposcopia non necessaria, ma 4 CIN2 e 2 CIN3 sarebbero stati mancati. Nonostante i 6 casi mancanti, non c’è stata alcuna perdita di sensibilità, ma la specificità è aumentata. La letteratura ha mostrato che il 40-60% dei casi CIN2 sarebbe regredito entro 2 anni (28, 29), e non tutti i casi CIN3 erano vere lesioni precancerose (30). Cook et al. hanno anche trovato un basso tasso di CIN2+ tra le donne mRNA-/DNA + (17). Pertanto, il rischio di cancro invasivo per le 6 donne era basso in un breve intervallo di tempo.

Abbiamo anche valutato le prestazioni del test in donne più anziane e più giovani. L’analisi specifica per età ha trovato che i tre test funzionavano meglio nelle donne con più di 30 anni. Sulla base del fatto che le donne più giovani con lesioni CIN avevano una maggiore possibilità di regressione, suggeriamo una gestione conservativa delle donne più giovani. Gli studi hanno trovato che l’infezione da HPV era comune nelle giovani donne, tuttavia, una gran parte di esse erano infezioni transitorie, e possono essere eliminate spontaneamente (31, 32). La breve durata della maggior parte delle infezioni da HPV in queste donne suggerisce che la displasia cervicale associata dovrebbe essere gestita in modo conservativo (12). Pertanto, il test HPV DNA potrebbe non essere un metodo di screening adatto alle donne di età inferiore ai 30 anni, a causa dell’alto tasso di falsi positivi. La performance di screening della citologia e dell’E6/E7 mRNA in modo completo nelle giovani donne dovrebbe essere valutata. Nel nostro studio, i dati hanno mostrato che la citologia ha la più alta specificità nelle donne sotto i 30 anni, ma la sensibilità è inferiore al test HPV DNA. Tuttavia, per E6/E7 mRNA, ha avuto una prestazione moderata nelle donne di età inferiore ai 30 anni, che ha avuto una sensibilità più elevata rispetto alla citologia accompagnata da una specificità più elevata rispetto all’HPV DNA, suggerendo che il test E6/E7 mRNA può essere un’opzione promettente per lo screening delle donne sotto i 30 anni.

Anche se la China Food and Drug Administration ha approvato tre vaccini HPV profilattici (cioè, Cervarix, Gardasil, e Cecolin), la prevenzione del cancro cervicale si basa ancora sullo screening. Nel 2009, il governo cinese ha lanciato uno screening gratuito del cancro cervicale a livello nazionale per le donne rurali. Nel 2015, il test HPV DNA è stato utilizzato come strumento di screening primario in siti pilota per la prima volta. Tuttavia, a causa della sua vasta popolazione, lo screening basato sul DNA dell’HPV comporterebbe inevitabilmente enormi falsi positivi, con conseguente spreco di risorse sanitarie e ansia inutile. È promettente che l’mRNA potrebbe essere utilizzato nel programma nazionale di screening del cancro cervicale per ridurre i falsi positivi senza perdere alcuna sensibilità.

Diverse limitazioni dovrebbero essere affrontate in questo studio. In primo luogo, questo è uno studio trasversale e non abbiamo potuto valutare il rischio di progressione delle lesioni associato all’HPV E6/E7 mRNA. Tuttavia, abbiamo stratificato i nostri dati per grado istologico, che fornisce informazioni sulla correlazione. In secondo luogo, è importante notare che i risultati non possono essere completamente generalizzati alla popolazione generale perché i partecipanti allo studio sono stati reclutati dall’ambulatorio in ospedale.

In conclusione, il test APTIMA mRNA ha avuto un buon accordo con il test Cobas 4800 HPV DNA con una sensibilità simile e una maggiore specificità per rilevare lesioni cervicali di alto grado. È promettente che l’mRNA possa essere usato nel programma nazionale cinese di screening del cancro cervicale per ridurre i falsi positivi senza perdere la sensibilità. Ulteriori studi sono necessari per valutare le prestazioni cliniche del test mRNA nelle donne più giovani in Cina.

Data Availability Statement

Tutti i set di dati generati per questo studio sono inclusi nell’articolo/materiale supplementare.

Ethics Statement

Gli studi che coinvolgono partecipanti umani sono stati rivisti e approvati dal ruolo della co-espressione di HPV E6/E7 mRNA e della proteina p16/Ki-67 nel prevedere il rischio di cancro cervicale. Dal Comitato di revisione etica delle scienze della vita dell’Università di Zhengzhou. Le pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio.

Contributi degli autori

S-KZ ha contribuito alla progettazione e ha scritto il manoscritto. ZG ha contribuito alla scrittura e alla revisione del manoscritto. PW, M-MJ, e P-PG hanno contribuito all’indagine e al test HPV DNA. L-NK e Z-NW hanno contribuito al test HPV mRNA. D-MZ ha contribuito all’esame citologico e istologico. QC e X-QC hanno eseguito l’analisi statistica. X-BS ha aiutato a concepire lo studio e ha assistito alle analisi statistiche. Y-LQ e J-GZ hanno aiutato a concepire lo studio e hanno assistito alla scrittura del manoscritto. J-GZ ha assistito nella realizzazione dello studio. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81502475) e Science and Technology Project of Henan Province (Grant No. 172102310067).

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che potrebbe essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Tutte le donne coinvolte in questo studio sono riconosciute per la loro partecipazione. Abbiamo anche apprezzato il contributo di tutti i medici rilevanti per questo studio e l’aiuto del National Cancer Center, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, e Peking Union Medical College. Abbiamo anche apprezzato la 32° Conferenza Internazionale sul Papillomavirus (IPVC 2018) per aver fornito una piattaforma per presentare l’abstract dello studio (titolo: Clinical Performance of HPV E6/E7 mRNA test to Detect Cervical High-grade Intraepithelial Neoplasia and Cancer: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Abbreviazioni

hr-HPV, papillomavirus umano ad alto rischio; VIA/VILI, ispezione visiva con acido acetico/ispezione visiva con soluzione di iodio di Lugol; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, 95% confidential intervals; ECC, endocervical curettage; TCT, test citologico ThinPrep; CIN, neoplasia cervicale intraepiteliale; LSIL, lesione squamosa intraepiteliale di basso grado; HSIL, lesione squamosa intraepiteliale di alto grado; LBC, citologia a base liquida; PPV, valore predittivo positivo; NPV, valore predittivo negativo; ASC-US, cellule squamose atipiche di significato indeterminato; ASC-H, cellula squamosa atipica non può escludere HSIL; AGC, cellula ghiandolare atipica; SCC, carcinoma a cellule squamose; AIS, adenocarcinoma in situ.