Effetti differenziali sulla permeabilità di membrana e sulla vitalità delle cellule di cheratinociti umani sottoposti a campi megasonici a bassissima intensità

L’effetto dell’esposizione a US a bassissima intensità (Ispta tra 7 e 16 mW/cm2, ben al di sotto della soglia di cavitazione, 100 mW/cm2) con una frequenza di 1 MHz è stato studiato sulle cellule HaCaT. Gli esperimenti sono stati eseguiti con una configurazione medica equivalente abbozzata nella Figura S1 di ESI, al variare dei parametri di trattamento, come Ispta, duty cycle e tempo di sonicazione. Esperimenti preliminari hanno evidenziato che, nella gamma di parametri di esposizione coinvolti qui, la temperatura è rimasta costante (entro 1 ° C) escludendo la dissipazione termica dell’energia degli Stati Uniti. Inoltre, i trattamenti non hanno mostrato alcuna dipendenza significativa degli effetti studiati dal duty cycle dell’onda US. Queste osservazioni sono coerenti con il basso assorbimento degli Stati Uniti a 1 MHz; al contrario, gli effetti termici e il duty cycle potrebbero influenzare le cellule e i tessuti esposti a frequenze più elevate, essendo il coefficiente di attenuazione degli Stati Uniti proporzionale alla frequenza23,31.

I risultati saranno inizialmente presentati considerando i due parametri di esposizione rilevanti, tempo di sonicazione e Ispta, separatamente. Le alterazioni strutturali e fisiche della membrana cellulare (permeabilità, efficienza di assorbimento e dimensione massima delle molecole internalizzate) saranno analizzate e correlate al danno citotossico corrispondente e alla possibile attivazione di modelli infiammatori. In seguito, i risultati saranno interpretati in termini di dose di sonicazione, definita come il prodotto dell’Ispta per il tempo di esposizione, cioè la densità superficiale dell’energia acustica incidente sul campione durante la sonicazione. In realtà, i fenomeni studiati dipendono da questa quantità e questo ci ha permesso di identificare una gamma di parametri di esposizione in cui si verifica un SP transitorio con danni biologici trascurabili.

Analisi dell’influenza del tempo di esposizione agli US

Le alterazioni della permeabilità di membrana delle cellule HaCaT indotte da US a bassa intensità a 1 MHz sono state stimate in termini di efficienza di assorbimento della calceina, una sonda fluorescente verde. Poiché le membrane intatte sono impermeabili alla calceina, essa rappresenta un marcatore affidabile per SP. La percentuale di cellule verdi-positive è stata quantificata da analisi di citometria a flusso secondo la sezione 2.5.

Al fine di valutare la sensibilità della permeabilità di membrana al tempo di esposizione agli Stati Uniti, un Ispta molto basso US è stato utilizzato. In particolare, già un Ispta di 7 ± 1 mW/cm2 effetti significativi sulla permeabilità di membrana possono essere innescati da tempi di esposizione adeguati. Risultati rappresentativi di indagine citometria a flusso parallelo su cellule HaCaT e NIH-3T3 entrambi sonicati a Ispta ~7 mW/cm2 per 5′, 15′, 30′ e 45′ sono mostrati in Fig. 1 (triangoli rossi e quadrati blu, rispettivamente). Come previsto, il confronto tra le linee cellulari dopo bassi tempi di sonicazione (sotto la soglia di sonorizzazione) risulta una scarsa affinità della calceina, dove le differenze (la più alta nelle cellule HaCaT) dovrebbero rappresentare le rispettive caratteristiche compositive e di permeabilità della membrana. Più importante, entrambe le linee cellulari mostrano un aumento significativo dell’efficienza di assorbimento a partire da 15′ di esposizione, che corrisponde ad una dose di sonicazione di (6,3 ± 0,9) J/cm2, suggerendo l’attivazione del processo SP. Secondo i migliori adattamenti di Fig. 1, per tempi di esposizione più lunghi, i nostri esperimenti indicano una correlazione lineare tra l’efficienza di assorbimento e il tempo di esposizione, con un tasso di assorbimento identico indotto da US sia in HaCaT e NIH-3T3 cellule (pendenze di regressione lineare (%/min) 1.3 ± 0.2, e 1.4 ± 0.2, per HaCaT e NIH-3T3, rispettivamente). Questo significherebbe che l’aumento dell’efficienza di assorbimento dovuto a SP è un fenomeno indipendente dalla linea cellulare.

Per indagare ulteriormente il processo SP e caratterizzare l’internalizzazione, le cellule HaCaT trattate sono state valutate mediante microscopia a fluorescenza. Coerentemente con i risultati della citometria a flusso, i campioni sonicati per 5′ non mostrano alcuna alterazione significativa della permeabilità di membrana rispetto al campione di controllo (non trattato), mentre a partire da 15′ si osserva un’efficienza di assorbimento crescente (come mostrato in Fig. 2 e Figura S2 di ESI) anche se non tutte le cellule hanno mostrato fluorescenza. Corrispondentemente, le cellule appaiono meno dense e aderenti rispetto al campione di controllo, suggerendo un allentamento delle tight-junctions. Le immagini rappresentative di Fig. 2 suggeriscono una localizzazione eterogenea della calceina all’interno delle cellule, e infatti la microscopia a fluorescenza confocale ha permesso di distinguere chiaramente all’interno delle cellule HaCaT la distribuzione periferica della sonda da quella interna (vedi immagine e ricostruzioni 3D di Fig. 3). Ulteriori immagini dettagliate sono mostrate nella sezione 3 di ESI. Le osservazioni sono coerenti con un uptake a due livelli del fluoroprobe: uno periferico, dove la sonda è localizzata nella rete del reticolo endoplasmatico intorno alla membrana plasmatica; l’altro, esposto significativamente dopo 30′ di esposizione, dove la diffusione della sonda nel citoplasma provoca una intensa fluorescenza uniformemente distribuita in tutta la cella, compreso il nucleoplasma. Va notato che il diametro di Stokes della calceina è ~ 1,36 nm e il suo trasporto intranucleare non è ostacolato da barriere diffusive29. Un’analisi più completa riportata nelle sezioni 3.2 e 3.3 permette di concludere che la dose di esposizione US e il peso molecolare della sonda erano fattori dominanti nel determinare l’assorbimento.

Un ulteriore saggio basato sul fluoroprobe PI rosso è stato eseguito per valutare il recupero della permeabilità della membrana nativa delle cellule sonicate (vedi anche Sezione 2.3). L’internalizzazione di PI denota l’attivazione di processi citotossici. La co-localizzazione dei coloranti verde e rosso all’interno delle cellule indica quindi il fallimento del processo di recupero della membrana dopo SP. D’altra parte, l’osservazione nelle cellule della fluorescenza verde in assenza di quella rossa indica il verificarsi di SP di membrana durante il trattamento con US e il suo recupero riuscito dopo lo spegnimento del campo. Immagini rappresentative della fluorescenza confocale sono mostrate in Fig. 4. La co-localizzazione dei due coloranti è assente nelle cellule trattate per 15′, mentre è scarsamente osservato dopo 30′ di esposizione (Figura S5 di ESI). Coerentemente, una perdita netta di vitalità di ~ 5% è stato rivelato, come controllato da citometria a flusso. Nelle cellule sonicate per 45′, corrispondente ad una dose di (19 ± 3) J/cm2, la co-localizzazione appare più evidente (vedi frecce bianche in Fig. 4B) e una perdita più significativa di vitalità si verifica (~ 10%, come controllato da citometria a flusso). Questi risultati suggeriscono che un tempo di esposizione più lungo, corrispondente a una dose più elevata a Ispta fissa, induce un’alterazione irreversibile nella struttura della membrana seguita da una conseguente risposta citotossica.

Analisi dell’influenza dell’intensità degli US

L’effetto della variazione dell’intensità del campo US applicato sulla permeabilità di membrana è stato analizzato sulla linea cellulare HaCaT dopo 15′ di esposizione, abbastanza breve da escludere effetti indotti da una sonicazione di lunga durata. Nel nostro studio US intensità erano nel range tra Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 e Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, ben al di sotto della soglia di cavitazione24. Secondo il protocollo descritto nelle sezioni 2.3 e 2.5, FITC-marcato destrani di MW diversi (MW = 10, 40 e 70 kDa) sono stati utilizzati per caratterizzare, per ogni intensità US, l’induzione della permeabilità di membrana alla dimensione diversa molecola. Questa procedura permette a sua volta di valutare la dimensione del sonoporo. Analogamente alla calceina, destrani non entrano significativamente le cellule non trattate31,32, mentre nel regime di cavitazione US l’assorbimento delle cellule di destrani marcati FITC può essere aumentato fortemente sia da SP che dalla promozione del traffico endosomico30. A questo proposito, i risultati delle misure di citometria a flusso riportati in Fig. 5 mostrano chiaramente una dimensione-dipendente uptake, un fenomeno che ci permette di escludere la concomitanza di effetti endocitosi attiva e, secondo la letteratura 22, suggerisce la bassa intensità-triggered SP come il principale meccanismo coinvolto nel trasporto di molecole di destrano attraverso la membrana plasmatica. In particolare, l’uptake osservato SP-indotto è caratterizzato da una soglia Ispta, linearmente crescente con l’aumento del MW delle molecole internalizzate. Al di sotto di questa soglia l’efficienza di assorbimento delle cellule trattate è paragonabile a quella delle cellule non esposte. I valori di soglia Ispta sono riportati nella tabella 1. Per intensità superiori alla soglia, l’efficienza di assorbimento aumenta con l’aumento di Ispta fino a raggiungere un massimo. Per il destrano 10 kDa, poi diminuisce leggermente fino a un plateau. La diminuzione osservata dell’efficienza di assorbimento ad alte intensità può essere spiegata dall’aumento del numero di cellule morte, che vengono rimosse dal campione durante il risciacquo, non contribuendo così alle analisi della citometria a flusso. Inoltre, l’attivazione di processi apoptotici potrebbe ostacolare l’internalizzazione del colorante. In particolare, per Ispta = 15 mW/cm2 anche se questo valore è molto inferiore alla soglia di cavitazione, le cellule sono in grado di internalizzare 70 kDa destrani, con un diametro di Stokes di ~ 12 nm. Questo valore può essere preso come una stima della dimensione minima dei sonopori prodotti nella membrana. In Figura S6 (Sezione 4 di ESI) è riportata una serie di immagini di fluorescenza rappresentative che mostrano l’assorbimento di destrani alla soglia Ispta insieme al test PI.

L’internalizzazione del PI evidenzia una significativa risposta citotossica a Ispta = 15 mW/cm2 (dose di esposizione 13,5 J/cm2). Come riportato da Udroiu et al.13 in condizioni sperimentali simili un leggero ma significativo aumento dell’incidenza di micronuclei è stato osservato anche in cellule NIH-3T3, a seconda dell’intensità e del tempo di esposizione a 1 MHz US. Queste osservazioni hanno suggerito che erano necessari ulteriori studi per comprendere meglio i bioeffetti che accompagnano lo SP di membrana, e quindi è stato effettuato uno studio della risposta biologica delle cellule sonicate in funzione dell’intensità degli US.

La risposta biologica alle “ferite di membrana” indotte dallo SP da intensità molto basse degli US è stata caratterizzata in modo approfondito valutando la morte cellulare, utilizzando il saggio combinato AnnexinV e PI descritto nella sezione 2.5 (vedi anche sezione 5 di ESI). Abbiamo anche valutato l’espressione del gene IL-6, una citochina che collega l’infiammazione cronica al cancro33,34. I risultati dell’analisi citometrica a flusso, espressi in termini di percentuale di cellule, sono riportati in Fig. 6. La vitalità cellulare è principalmente conservata (>90%) durante i trattamenti 15′, tuttavia, a partire da Ispta = 9 mW/cm2 si verifica una leggera diminuzione, accompagnata da un aumento delle cellule apoptotiche precoci. A Ispta = 14 mW/cm2 si comincia ad osservare una percentuale significativa di cellule necrotiche, mentre a Ispta = 16 mW/cm2 anche l’apoptosi tardiva contribuisce alla morte cellulare, in corrispondenza di una leggera riduzione della necrosi (trame rappresentative dei punti della citometria a flusso in Figura S7 di ESI). L’espressione del gene IL-6 è stata determinata mediante RT-PCR (Fig. 7). Nessun up-regulation è stato osservato per Ispta ≤15 mW/cm2 mentre il trattamento a 16 mW/cm2 ha indotto una sovraespressione di questo gene rispetto a quello delle cellule non trattate.

Questi risultati suggeriscono che, a partire da una soglia Ispta di 16 mW/cm2 e 15′ di sonicazione, il danno di membrana causato da US non solo diminuisce la vitalità cellulare ma anche, attraverso la sovraespressione del gene IL-6 legato all’infiammazione, potrebbe indurre una risposta infiammatoria. Poiché diverse ricerche hanno riconosciuto un ruolo dell’infiammazione nel promuovere la patogenesi e la progressione di malattie come il cancro35,36, sono necessarie ulteriori indagini per caratterizzare meglio gli aspetti relativi ai modelli infiammatori.

Analisi dell’influenza della dose di sonicazione

Per analizzare quantitativamente la relazione tra il campo US applicato e gli effetti biologici osservati in termini di energia fornita alle cellule durante l’esposizione, la dose di sonicazione è stata calcolata per ogni trattamento come il prodotto dell’intensità Ispta per il tempo di esposizione. I valori ottenuti sono riportati nella tabella 2, dove gli effetti biologici osservati sono identificati da colori di fondo. I nostri risultati suggeriscono che la SP di membrana si verifica a partire da una dose soglia di circa 6,3 J/cm2. Inoltre, la dimensione dei sonopori può essere correlata alla dose di sonicazione. Per dosi superiori a 10,8 J/cm2 si osserva una diminuzione della vitalità e concomitanti eventi di apoptosi precoce nella cellula trattata, seguita a partire da 14,4 J/cm2 da apoptosi tardiva, necrosi e sovraespressione di IL-6.

Sottolineiamo che questa dose, e Ispta 16 mW/cm2, corrisponde a una pressione di picco negativa di ~0,02 MPa. Questo valore sembra abbastanza alto per indurre stress meccanico all’interfaccia membrana plasmatica/acqua, anche se cade un ordine di grandezza inferiore al valore di soglia di sicurezza dell’esposizione suggerito finora (indice meccanico ~0.2-0.3, a 1 MHz).

Si noti che i nostri esperimenti sono stati confrontati con successo con quelli eseguiti utilizzando un sistema elettromedicale effettivamente impiegato nella terapia USA (vedi anche Sezione 2.2), evidenziando così la rilevanza medica del nostro approccio. A questo proposito, siamo fiduciosi che fornire informazioni sulla dose di sonicazione (alla frequenza fissa US) permette un indice più completo di caratterizzazione della risposta cellulare all’esposizione US e, a sua volta, una fine identificazione di una gamma di parametri in cui SP transitorio si verifica con danni biologici trascurabili.

Un passo molto importante verso la comprensione dell’impatto biologico in vivo dei nostri risultati sarebbe quello di operare esposizioni US su biosistemi tridimensionali, come i tessuti umani composti da cheratinociti multi-stacked o da cellule endoteliali della barriera cerebrale del sangue.