Abstract
Il liquido amniotico (AF) e la membrana amniotica (AM) sono stati recentemente caratterizzati come fonti promettenti di cellule staminali o progenitrici. Entrambi non solo contengono sottopopolazioni con caratteristiche di cellule staminali che assomigliano alle cellule staminali adulte, come le cellule staminali mesenchimali, ma mostrano anche alcune proprietà delle cellule staminali embrionali come (i) espressione di marcatori di pluripotenza, (ii) alta espansione in vitro, o (iii) capacità di differenziazione multilineare. Sforzi recenti si sono concentrati sull’isolamento e la caratterizzazione dettagliata di questi tipi di cellule staminali. Tuttavia, le variazioni nel loro fenotipo, la loro eterogeneità descritta da diversi gruppi, e l’assenza di un singolo marcatore espresso solo in queste cellule possono impedire l’isolamento di una popolazione di cellule staminali pura e omogenea da queste fonti e il loro potenziale utilizzo di queste cellule in applicazioni terapeutiche. In questo articolo, ci proponiamo di riassumere i recenti progressi nella scoperta di marcatori per le cellule staminali derivate da fonti fetali come la FA e la AM, utilizzando nuove metodologie basate sulla trascrittomica, la proteomica o le analisi del secretoma.
1. Introduzione
Sia il liquido amniotico (AF) che la membrana amniotica (AM) rappresentano ricche fonti di cellule staminali che possono essere utilizzate in futuro per applicazioni cliniche terapeutiche. Le preoccupazioni etiche riguardanti l’isolamento delle cellule staminali da queste fonti sono ridotte al minimo, al contrario delle questioni che emergono dalla ricerca sulle cellule staminali embrionali umane (ESC). La FA viene raccolta durante le amniocentesi programmate tra la 15a e la 19a settimana di gestazione per la diagnosi prenatale e l’eccesso di campione può essere utilizzato per l’approvvigionamento di cellule, mentre la AM viene solitamente raccolta durante i parti cesarei delle gravidanze a termine. Data l’eterogeneità delle popolazioni di cellule staminali derivate da queste fonti, l’isolamento di specifici tipi di cellule è difficile e richiede una dettagliata caratterizzazione fenotipica e molecolare delle rispettive cellule. Gli studi che includono approcci omici sono fondamentali per comprendere meglio i meccanismi di espressione molecolare di queste cellule e definire le metodologie corrette per il loro isolamento, prima del loro utilizzo in approcci terapeutici.
Questo articolo mira a presentare le principali caratteristiche biologiche e molecolari delle cellule staminali derivate da FA e AM e anche a sottolineare i recenti progressi nella scoperta di marcatori utilizzando metodologie globali, come la trascrittomica, la proteomica, o le analisi del secretoma.
1.1. Il liquido amniotico
AF serve come liquido protettivo per l’embrione in via di sviluppo, fornendo supporto meccanico e i nutrienti necessari durante l’embriogenesi. L’amniocentesi è stata utilizzata per molti decenni come procedura di routine per la cariotipizzazione fetale e la diagnosi prenatale, consentendo l’individuazione di una varietà di malattie genetiche.
Il componente principale della FA è l’acqua; tuttavia la sua composizione complessiva varia durante la gravidanza. All’inizio della gravidanza, l’osmolarità amniotica è simile al plasma fetale. Dopo la cheratinizzazione della pelle fetale l’osmolarità amniotica diminuisce relativamente al plasma materno o fetale, principalmente a causa dell’afflusso di urina fetale. Più interessante, AF rappresenta anche una ricca fonte di una popolazione di cellule staminali derivanti sia dal feto o dalla membrana amniotica circostante. Ulteriori indagini da parte di diversi gruppi sono state recentemente focalizzate sulle proprietà cellulari delle cellule derivate dall’amniotica e il loro potenziale utilizzo in modelli preclinici e nelle terapie di trapianto. Le cellule staminali del liquido amniotico (AFSCs)
Le cellule del liquido amniotico (AFCs) rappresentano una popolazione eterogenea derivata dai tre strati germinali. Queste cellule condividono un’origine epiteliale e derivano sia dall’embrione in via di sviluppo che dalla superficie interna della membrana amniotica, che sono caratterizzate come cellule staminali della membrana amniotica. Le AFC sono principalmente composte da tre gruppi di cellule aderenti, classificate in base alle loro caratteristiche morfologiche, di crescita e biochimiche. Le cellule epitelioidi (tipo E) sono cellule da cuboidali a colonnari derivate dalla pelle fetale e dalle urine, le cellule del liquido amniotico (tipo AF) provengono dalle membrane fetali, e le cellule fibroblastiche (tipo F) sono generate principalmente dal tessuto connettivo fibroso. Sia le cellule di tipo AF che quelle di tipo F condividono una morfologia fibroblastoide e il tipo di cellula dominante sembra essere quella di tipo AF, che coesprime cheratine e vimentine. Diversi studi hanno documentato che le cellule staminali del liquido amniotico umano (AFSCs) possono essere facilmente ottenute da una piccola quantità di AF del secondo trimestre, raccolte durante l’amniocentesi di routine, una procedura con un tasso di aborto spontaneo che va dallo 0,06 allo 0,5%. Fino ad oggi, sono stati riportati diversi protocolli di coltivazione che hanno portato a popolazioni di cellule staminali arricchite. L’isolamento delle AFSC e i rispettivi protocolli di coltura sono stati riassunti in una recente revisione di Klemmt et al. e possono essere classificati come segue: (i) un protocollo di coltivazione a passo singolo, in cui la cultura primaria è stata lasciata indisturbata per 7 giorni o più fino alla comparsa delle prime colonie, (ii) un protocollo di coltivazione a due passi, in cui gli amniociti, non attaccati dopo 5 giorni in coltura, sono stati raccolti e ulteriormente espansi, (iii) selezione del marcatore di superficie cellulare per CD117 (recettore c-kit), (iv) isolamento meccanico delle colonie iniziali di cellule progenitrici mesenchimali formate nelle culture iniziali, e (v) culture a breve termine per isolare colonie fibroblastoidi. La maggior parte delle AFSCs, isolate secondo queste metodologie, condividevano un fenotipo mesenchimale multipotente e mostravano un potenziale di proliferazione più elevato e un potenziale di differenziazione più ampio rispetto alle MSC adulte. Membrana amniotica (AM)
La membrana amniotica, priva di tessuto vascolare, forma la maggior parte dello strato interno della membrana fetale ed è composta da 3 strati: (i) un monostrato epiteliale composto da cellule epiteliali, (ii) uno strato intermedio basale acellulare, e (iii) uno strato esterno di cellule mesenchimali, ricco di cellule staminali mesenchimali e posto in prossimità del corion . AM è stata utilizzata in clinica per molti decenni per la guarigione delle ferite nelle ustioni, promuovendo la formazione dell’epitelio e proteggendo dalle infezioni. Recentemente, l’uso di AM è stato valutato come materiale di medicazione per difetti chirurgici della mucosa orale, ricostruzione della superficie oculare, perforazioni corneali e aumento della vescica. Cellule staminali a membrana amniotica (AMSCs)
Le cellule staminali a membrana amniotica (AMSCs) comprendono due tipi, le cellule epiteliali amniotiche (AECs) e le cellule staminali mesenchimali a membrana amniotica (AM-MSCs) derivate rispettivamente dagli strati epiteliali amniotici e mesenchimali amniotici. Entrambi i tipi di cellule hanno origine durante le fasi di pregastrulazione dell’embrione in via di sviluppo, prima della delineazione dei tre strati germinali primari e sono per lo più di natura epiteliale. Una varietà di protocolli sono stati stabiliti per AECs e AM-MSCs isolamento, principalmente basato sulla separazione meccanica della AM dalla membrana corionica e la successiva digestione enzimatica. AM-MSCs esposto aderenza plastica e morfologia fibroblastoide, mentre AECs visualizzato un fenotipo epiteliale ciottolo. Le AM-MSC hanno condiviso caratteristiche fenotipiche simili a quelle derivate da fonti adulte. Più interessante è il fatto che le AM-MSC, come le AF-MSC, hanno esibito un tasso di proliferazione più elevato rispetto alle MSC derivate da fonti adulte e un potenziale di differenziazione multilineare in cellule derivate dai tre strati germinali. Cellule staminali del liquido amniotico
La FA è recentemente emersa come fonte alternativa fetale di una varietà di cellule di origine staminale. Qui, ci proponiamo di riassumere i marcatori chiave che caratterizzano le AFSCs. Ad oggi, le MSC rappresentano la sottopopolazione meglio caratterizzata delle AFSCs. Le AF-MSCs hanno esibito la tipica espressione dei marcatori mesenchimali, come CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, e CD44, determinata dalle analisi della citometria a flusso. Inoltre, queste cellule hanno espresso gli antigeni HLA-ABC, mentre l’espressione dei marcatori ematopoietici CD34 e CD45, il marcatore endoteliale CD31 e l’antigene HLA-DR non è stato rilevato. Ancora più importante, la maggior parte delle AF-MSC coltivate esprimeva marcatori di pluripotenza come la proteina legante l’ottametro 3/4 (Oct-3/4), il fattore di trascrizione homebox Nanog (Nanog), e l’antigene embrionale stadio-specifico 4 (SSEA-4).
È stato anche riportato che le colture di amniociti contengono una piccola popolazione di cellule positive al CD117 (una tirosin-chinasi specifica per il fattore delle cellule staminali presente principalmente nelle ESC e nelle cellule germinali primordiali) che possono essere espanse clonalmente in cultura. Le proprietà di differenziazione delle AFS CD117+ sono state testate per la prima volta in vivo, dimostrando in questo modo la loro identità di cellule staminali. L’evidenza sperimentale ha suggerito che le AFSC derivano da cellule fibroblastoidi a forma di fuso.
Nel tentativo di analizzare le sottopopolazioni AFSCs, il nostro gruppo ha recentemente identificato due popolazioni morfologicamente distinte di AFSCs di origine mesenchimale, con diverse proprietà di proliferazione e differenziazione, denominate a forma di fuso (SS) e a forma rotonda (RS). Entrambe le sottopopolazioni esprimevano marcatori di cellule staminali mesenchimali a livelli simili. Tuttavia, è stato identificato che le colonie SS esprimevano livelli più elevati di antigeni CD90 e CD44 rispetto alle colonie RS. Cellule staminali a membrana amniotica (AMSCs)
Un’analisi dettagliata dell’immunofenotipo delle AMSCs ha rivelato l’espressione di antigeni, come CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , marcatore delle cellule staminali stromali 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, collagene I e III (Col1/Col3), actina alfa-muscolare liscia (α-SMA), CD44, vimentina (Vim), proteina superficiale dei fibroblasti (FSP) e antigene HLA-ABC. Tuttavia, la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) è stata espressa a livelli molto bassi e le proteine TRA-1-60, la proteina di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1), il fattore von Willebrand (vWF), la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche (PECAM-1), CD3 e HLA-DR non sono state rilevate. Una delle proteine più abbondanti trovate nelle cellule derivate da AM è la laminina, che svolge un ruolo chiave nella differenziazione, nella forma e nella migrazione delle cellule e nella rigenerazione dei tessuti. L’analisi RT-PCR ha inoltre dimostrato che le AMSC hanno espresso geni come Oct-3/4, zinc finger protein 42 (zfp42 o Rex-1), la proteina fattore delle cellule staminali (SCF), la molecola di adesione delle cellule neurali (NCAM), la nestina (NES), la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4), la proteina legante GATA 4 (GATA-4), e il fattore nucleare epatocitario 4α (HNF-4α) anche in passaggi elevati. Brachyury, fattore di crescita dei fibroblasti 5 (FGF5), paired box protein (Pax-6), e la proteina morfogenetica ossea 2 (BMP2) non sono stati rilevati trascritti. Allo stesso modo, le AEC erano positive per CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, e negative per le espressioni CD14, CD34, CD45, CD49d, e HLA-DR, come determinato da analisi FACS. Ulteriori indagini hanno mostrato che AECs stavano esprimendo marcatori delle cellule staminali come SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, sex determining region Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 e Tra1-80, fibroblast growth factor 4 (FGF4), Rex-1, cryptic protein (CFC-1), e prominin 1 (PROM-1) .
3. Transcriptomics
3.1. Cellule staminali del fluido amniotico
Un’analisi funzionale della firma di espressione genica delle AF-MSC rispetto al midollo osseo (BM-), al sangue cordonale (CB-) e alle AM-MSC è stata inizialmente eseguita da Tsai et al. I geni espressi nelle MSC di tutte e tre le fonti potrebbero essere classificati in gruppi relativi a (i) rimodellamento della matrice extracellulare (CD44, collagene II (COL2), fattore di crescita insulino-simile 2 (IGF2), e inibitore tissutale della metalloproteinasi 1 (TIMP1)), (ii) regolazione del citoscheletro (attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (PLAU) e recettore (PLAUR)), (iii) regolazione delle chemochine e adesione (alfa actinina 1 (ACTN1), subunità 1B del complesso proteico legato all’actina (ARPC1B) e trombospondina 1 (THBS1)), (iv) attivazione della plasmina (inibitore della via del fattore di tessuto 2 (TFPI2)), (v) segnalazione del recettore del fattore di crescita trasformante β (TGFβ) (caveolina 1 (Cav1), caveolina 2 (Cav2), inibitore della chinasi ciclina-dipendente 1A (CDKN1A)), e (vi) geni che codificano le ligasi E3 ubiquitina (SMURF). I geni upregolati nelle AF-MSCs rispetto alle BM-, CB-, e AM-MSCs includevano molecole coinvolte nella maturazione e contrazione uterina, come il recettore dell’ossitocina (OXTR) e la regolazione della sintesi delle prostaglandine, come la fosfolipasi A2 (PLA2G10). Altri geni upregolati in questo gruppo sono stati coinvolti nella trasduzione del segnale relativa a (i) risposta innescata dalla trombina ((F2R e F2RL)), (ii) segnalazione del riccio ((hedgehog aciltransferase (HHAT)), e (iii) percorsi legati alle proteine G (rho-related GTP-binding protein (RHOF), regolatore della segnalazione delle proteine G 5 e 7 (RGS5, RGS7), e fosfolipasi C beta 4 (PLCB4)).
In studi recenti sulle AFSC, Kim et al. hanno descritto per la prima volta i cambiamenti di espressione genica nella popolazione totale AFSC durante diversi passaggi mediante analisi microarray illumina. 1970 geni differenzialmente espressi sono stati rilevati e classificati secondo i loro profili di espressione in 9 cluster distinti. I geni con livelli di espressione gradualmente crescenti includevano la chemochina (C-X-C motif) ligando 12 (CXCL12), la cadherina 6 (CDH6), e il recettore 3 del folato (FOLR3). I geni downregolati erano, tra gli altri, la ciclina D2 (CCND2), la cheratina 8 (K8), IGF2, il precursore del peptide natriuretico (BNP) B, e la proteina legante l’acido retinoico cellulare 2 (CRABPII). Per ottenere ulteriori informazioni, l’analisi dei dati del chip sui geni dell’invecchiamento è stata eseguita e ha rivelato l’upregulation dei trascritti genici, come il fattore di crescita nervosa beta (NGFβ), il substrato del recettore dell’insulina 2 (IRS-2), la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 3 (IGFBP-3), e l’apolipoproteina E (APOE). Espressione di geni come PLAU, fattore di trascrizione E2F 1 (E2F1), IGF2, gene della suscettibilità al cancro al seno di tipo 1 (BRCA1), topoisomerasi 2 alfa del DNA (TOP2A), antigene nucleare delle cellule proliferanti (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), gene della ciclina-A2 (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B), e cyclin dependent kinase 1 (CDC2), era gradualmente downregulated durante la cultura .
Wolfrum et al. hanno eseguito un’analisi globale dell’espressione genica delle AFSCs rispetto alle iPSCs derivate da AF (AFiPSC) e ESCs . Tra questi, i geni legati all’autorinnovamento e alla pluripotenza (1299 geni, ad esempio, POU classe 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, proteina legante i microRNA LIN28) e alla specificità delle AFSCs (665 geni, ad esempio, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatosi tipo 2 (NF2), protectin (CD59), tumor necrosis factor superfamily member 10 (TNFSF10), 5′-nucleotidasi (NT5E)) sono stati rilevati in AFSCs . Inoltre, gli autori hanno esaminato l’espressione dei geni associati alla senescenza e ai telomeri nelle AFSCs di passaggio iniziale e successivo, al fine di studiare l’effetto della riprogrammazione sull’aggiramento della senescenza osservata nelle colture AFSC. Sessantaquattro geni sono stati identificati come differenzialmente espressi nelle AFSC rispetto alle linee AFiPSC. Di questi, i geni associati ai telomeri e i geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare, come l’arresto mitotico deficient-like 2 (MAD2L2), la polimerasi 1 (PARP1), la proteina A3 di replicazione (RPA3), la discheratosi congenita 1 (DKC1), il mutS homolog 6 (MSH6), il checkpoint homolog CHK1 (CHEK1), la polo-like kinase 1 (PLK1), il POU classe 2 homeobox 1 (POU2F1), il CDC2, il gene della sindrome di Bloom RecQ helicase-like (BLM), la sindrome di Werner RecQ helicase-like (WRN), la DNA methyltransferase 1 (DNMT1), la DNA methyltransferase 3 beta (DNMT3B), la lamin B1 (LMNB1), e il fattore di replicazione del DNA 1 (CDT1), sono stati downregolati nelle AFSCs rispetto alle AFiPSCs ed ESCs. Al contrario, la peptidylprolyl cis/trans isomerase (PIN1), lamina A/C (LMNA), l’arresto della crescita e il danno al DNA inducibile alfa (GADD45A), il cromobox homolog 6 (CBX6), la NADPH ossidasi 4 (NOX4), l’endoglin (ENG), istone H2B tipo 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A fattore di differenziazione della crescita 15 (GDF15), e inibitore della serina proteasi 1 (SERPINE1), tra gli altri, sono stati upregolati in AFSCs rispetto a AFiPSCs e ESCs .
3.2. Cellule staminali a membrana amniotica
L’analisi trascrittomica utilizzando microarray di DNA è stata riportata per le AM-MSC. Questi dati sperimentali hanno fornito informazioni sul modello di espressione genica delle AM-MSC rispetto ai profili di espressione genica delle AF, CB e BM-MSC. Sono stati identificati diversi geni upregolati in AM-MSCs coinvolti nella regolazione dell’adattamento immunitario tra l’interfaccia materno-placentare. Tra gli altri, spondina 2 (SPON2), interferone, proteina alfa inducibile 27 (IFI27), recettore B1 della bradichinina (BDKRB1), piccola sottofamiglia di citochine inducibili B membro 5 e 6 (SCYB5, SCYB6), e Yamaguchi sarcoma viral-related oncogene homolog (LYN) sono stati trovati per essere upregolati. Inoltre, altri geni con una maggiore espressione in AM-MSCs rispetto a AF, CB, e BM-MSCs incluso (i) fattori di trascrizione, come forkhead box F1 (FOXF1), cuore e derivati della cresta neurale espresso 2 (HAND2), e fattore di trascrizione 21 (TCF21) e (ii) enzimi metabolici, come dipeptidyl-peptidase 6 (DPP6), triptofano 2,3 diossigenasi (TDO2), e sialiltransferasi (STs) .
4. Proteomica
4.1. Cellule staminali del fluido amniotico
Gli studi proteomici sulla popolazione totale AFSC, comprese le cellule epitelioidi (tipo E), specifiche del fluido amniotico (tipo AF) e fibroblastiche (tipo F), hanno rivelato 2400 spot che hanno portato all’identificazione di 432 diversi prodotti genici. La maggior parte delle proteine era localizzata nel citoplasma (33%), nei mitocondri (16%) e nel nucleo (15%) e rappresentava principalmente enzimi (174 proteine) e proteine strutturali (75 proteine). Era presente anche una percentuale relativamente alta di proteine di membrana e associate alla membrana (7%). Tra le proteine rilevate, 9 erano corrispondenti alle cellule epiteliali, come la catena D dell’ATP sintasi (ATP5H), la subunità 30 kDa della NADH-ubiquinone ossidoreduttasi (NUIM), l’annexina II (Anx2), l’annexina IV (Anx4), la proteina ribosomiale 40S SA (Rpsa), la glutatione S-transferasi P (GSTP), la proteina della volta maggiore e le citocheratine 19 e 7 (CK-19, CK-7), mentre 12 proteine sono state segnalate per essere espresse nei fibroblasti, tra cui fibronectine, tropomiosine, transgelina (TAGLN), subunità 34 kDa del complesso arp2/3 (P34-arp), gelsolina (Gsn), fattore di elongazione 1-β (EF-1β) e altre. Otto proteine sono state trovate per essere espresse in cheratinociti, tra cui cheratine, ribonucleoproteine, Anx2, aetyl-CoA acetil-transferasi (ACAT1), e altri, tre per essere espresso in epidermide, tra cui tropomiosine e cheratine e uno in cellule di tipo mesenchimale (vimentina 1 (Vim 1)) .
Studi recenti hanno fornito la prova che una diversità di espressione degli enzimi metabolici nelle cellule dell’amnion è coinvolta nelle sindromi metaboliche e genetiche, e quindi, la loro individuazione potrebbe essere importante per la diagnosi prenatale. Un’analisi più dettagliata per determinare gli enzimi metabolici specifici presenti nelle AFSC è stata riportata da Oh et al. Sono state identificate novantanove proteine, come gli enzimi di manipolazione dei carboidrati, gli enzimi di manipolazione degli aminoacidi, le proteine del metabolismo delle purine e gli enzimi del metabolismo intermedio.
Un’analisi proteomica è stata eseguita anche su diversi passaggi di coltura delle AFSC CD117+, mostrando variazioni nell’espressione delle proteine che si verificavano principalmente nei primi passaggi. Ventitré proteine sono state espresse differentemente tra i passaggi precoci e tardivi con le proteine più appiccicose downregolate, la Col1, la Col2, la vinculina (Vcl), la CRABP II, la stathmin (STMN1), e la cofilina-1 (CFL1). Al contrario, TAGLN e Col3 sono aumentati durante i passaggi. Le proteine che hanno mostrato livelli disregolati lungo i passaggi erano la subunità 7 regolatrice della proteasi 26S (PSMD7), l’isoenzima L1 dell’ubiquitina carbossil terminale idrolasi (UCH-L1), la proteina ribonucleare nucleare eterogenea H (hnRNP H), e la proteina TAR DNA-binding 43 (TDP-43) .
Nel 2007, la mappa proteomica delle AF-MSC umane è stata costruita e confrontata direttamente con quella derivata dalle BM-MSC. 261 diverse proteine sono state identificate nelle AF-MSCs con la maggior parte delle proteine localizzate nel citoplasma (41%), mentre altre sono state trovate nel reticolo endoplasmatico (8%), nucleo (13%), mitocondri (12%), ribosomi (1%), citoscheletro (6%), citoplasma e nucleo (5%), e proteine secrete (2%). Le AF-MSC hanno espresso un certo numero di proteine legate alla proliferazione e al mantenimento delle cellule, come l’ubiquilina-1 (UBQLN1), che è nota per controllare la progressione del ciclo cellulare e la crescita cellulare, la proteina 2G4 associata alla proliferazione (PA2G4), una proteina nucleolare regolatrice della crescita, la proteina secreta acida e ricca di cisteina (SPARC), che è regolata durante l’embriogenesi ed è coinvolta nel controllo del ciclo cellulare e dell’adesione cellulare, e l’enhancer of rudimentary homolog (ERH) che regola anche il ciclo cellulare. TAGLN e galectina 1 (Gal 1), entrambe presenti nelle cellule staminali e legate al differenziamento, erano anche abbondantemente espresse nelle AF-MSCs. Altre proteine espresse ad alti livelli nelle AF-MSCs erano legate (i) allo sviluppo, come Deltex-3-like (DTX3L), e (ii) all’organizzazione e al movimento del citoscheletro, come CFL1, la proteina coactosin-like (CLP), e la proteina abilitata omologo (Enah). Come previsto, Vim era anche espresso in quantità elevate nelle AF-MSCs. In questo studio, è stato anche descritto un confronto dettagliato delle proteine comuni identificate nelle cellule AF e nelle AF-MSC.
Nel nostro studio successivo, abbiamo stabilito la mappa proteomica dei due tipi di cellule progenitrici mesenchimali AF morfologicamente distinte (SS e RS) mediante 2-DE. Venticinque proteine sono state espresse differentemente nelle due sottopopolazioni. Le proteine upregolate nelle SS-AF-MSCs rispetto alle RS-AF-MSCs includevano il precursore della reticolocalbina-3 (RCN3), il collagene α1 (I) (COL1α1), il precursore della proteina 9 FK506-binding (FKBP9), l’inibitore 1 della dissociazione del Rho GDP (RhoGDI), la proteina 4 del canale intracellulare del cloruro (CLIC4), la triptofanil-tRNA sintetasi (TrpRS), e la proteina 70 kD dello shock termico (HSP70). La pererossidossina 2 (Prdx2), la proteina da shock termico 60 kD (HSP60), la GSTP e l’Anx4 sono state upregolate nelle RS-AFMPCs. Tuttavia, le proteine identificate nelle RS-AF-MSCs includevano solo citocheratina-8, -18 e -19 (CK-8, -18 e CK-19), catepsina B (CTSB), CLP e proteina αV dell’integrina (CD51). Le proteine legate alla mesenchimale, come Vim, Gal, Gsn, e prohibitin (PHB), erano espresse agli stessi livelli in entrambe le popolazioni. Cellule staminali di membrana amniotica
Un approccio dettagliato per studiare le proteine AM umane è stato descritto da Hopkinson et al. In questo studio, gli autori hanno eseguito un’analisi proteomica di campioni AM preparati per il trapianto umano, utilizzando gel 2-DE. Sono stati esaminati anche i mezzi di lavaggio dei campioni AM e sono state identificate le proteine secrete. Le proteine rilevate sia nella AM che nei mezzi di lavaggio hanno suggerito che si è verificato un parziale rilascio di proteine. Queste proteine erano per lo più proteine citoplasmatiche solubili e sono state classificate secondo la loro localizzazione subcellulare e la loro funzione. Un esempio delle proteine più abbondanti e coerenti in AM è THBS1 che è segnalato per svolgere un ruolo nella riparazione delle ferite, risposta infiammatoria e angiogenesi. Mimecan (chiamato anche osteoglicina/OGN) è un’altra proteina rilevata in AM che rappresenta un piccolo proteoglicano ricco di leucina, trovato nella ECM del tessuto connettivo. Si dice che il mimecan mantenga la resistenza alla trazione e l’idratazione del tessuto. Inoltre, la forma più grande di mimecan era espressa nelle cellule AM ed era suscettibile di scissione proteolitica. La proteina ig-h3 indotta dal TGF-β (βIG-H3), una molecola adesiva ECM che agisce come un fattore di crescita associato alla membrana durante la differenziazione cellulare e la guarigione delle ferite, e l’intergrina α6 (CD49f), un componente dell’integrina α6β4, erano anche presenti in quantità significative nelle cellule AM. È noto che l’interazione α6β4-βIG-H3 gioca un ruolo importante nel mediare l’adesione cellulare e le vie di segnalazione della riparazione della ferita.
Un altro importante studio di Baharvand et al. si è concentrato sull’analisi dell’AM umana denudata dall’epitelio mostrando differenze sia quantitative che qualitative rispetto all’AM non trattata. Hanno studiato il proteoma dell’epitelio AM umano, che è stato utilizzato come nicchia di cellule staminali limbari per il trattamento della ricostruzione della superficie oculare . 515 macchie sono state rilevate in tutti i gel 2-DE e 43 proteine sono state identificate utilizzando MALDI TOF/TOF MS in AM. Le proteine più abbondanti erano diverse isoforme di lumicano (LUM) e OGN, entrambi membri della famiglia dei proteoglicani (PG). In particolare, OGN potrebbe avere un ruolo in molti processi biologici tra cui la crescita cellulare, l’angiogenesi e l’infiammazione. Altre proteine rilevate includevano il collagene VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), la catena beta del fibrinogeno (FGB), la transglutaminasi 2 isoforma A (TGM2A), la variante b-actina (ACTB), la proteina 5 da shock termico 70 kD (HSPA5), il nidogeno 2 (NID2), CD49f, βIG-H3, e la nefrite tubulointerstiziale (TIN). Alcune delle proteine identificate in questo studio erano anche legate alla matrice extracellulare (ECM). Tra quelle individuate, la fibronectina (FN), le laminine e il collagene IV (Col4) e VII sono stati segnalati per promuovere l’adesione e la migrazione epiteliale. Secretome
Di recente, sono stati fatti progressi significativi per quanto riguarda l’analisi delle proteine secrete dagli AFSC. È stato documentato che il secretoma delle AFSC era responsabile del miglioramento della vasculogenesi ed era in grado di evocare una forte risposta angiogenica nei riceventi murini. Secondo questo studio, un’analisi dettagliata dei mezzi condizionati da AFSC ha rivelato la presenza di fattori proangiogenici e antiangiogenici noti utilizzando la tecnologia MAP della Luminex. Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), il fattore 1 derivato dalle cellule stromali (SDF-1), l’interleuchina 8 (IL-8), la proteina 1 chemiotattica dei monociti (MCP-1) e due inibitori dell’angiogenesi, l’interferone-gamma (IFNγ) e la proteina 10 indotta dall’interferone gamma (IP-10), sono stati identificati come proteine secrete. È stato anche dimostrato che un numero relativamente piccolo di AFSC era sufficiente per secernere una quantità rilevabile di fattori di crescita proangiogenici e citochine. La secrezione di questi può essere regolata in modo dose-dipendente secondo il numero iniziale delle cellule utilizzate.
Uno studio sistematico sulle proteine secrete dalle AFSC ha portato alla conclusione che i fattori solubili proangiogenici delle AFSC possono mediare il reclutamento dei progenitori endoteliali in un modello di ratto ischemico. In particolare, il mezzo condizionato derivato dalle AFSCs potrebbe fornire topicamente fattori di crescita angiogenici e citochine nel lembo di pelle del modello di ratto ischemico ed era responsabile dell’innesco della riparazione endogena reclutando cellule progenitrici endoteliali.
Nei nostri studi recenti, abbiamo esaminato il potenziale terapeutico di una AF-MSCs e le loro molecole secrete nei topi con insufficienza epatica acuta. Una varietà di citochine e fattori di crescita sono stati rilevati nel mezzo condizionato AF-MSC. Sono state rilevate citochine come l’interleuchina 10 (IL-10), l’interleuchina 27 (IL-27), la famiglia dell’interleuchina 17 (IL-17E), l’interleuchina 12p70 (IL-12p70), l’interleuchina-1 beta (IL-1β) e l’antagonista del recettore dell’interleuchina-1 (IL-1ra), responsabili dell’induzione della downregulation locale e sistemica dei mediatori pro-infiammatori. Sono stati secreti anche SERPINE1, MCP-1 e SDF-1, responsabili della promozione della riparazione dei tessuti. È interessante notare che tra i fattori di crescita altamente espressi c’erano il fattore di crescita delle cellule endoteliali derivate dalle piastrine (PD-ECGF), l’endostatina/collagene XVII (EN/Col17), l’attivatore del plasminogeno urinario (uPA), TIMP1, TIMP2, il fattore di crescita EGF-like legato all’eparina (HB-EGF), il fattore di crescita dei fibroblasti 7 (FGF7) e il fattore di crescita epidermico (EGF), responsabili della rigenerazione epatica e della riparazione dei tessuti.
6. Riassunto
I dati attuali finora suggeriscono che il liquido amniotico e la membrana amniotica possono rappresentare fonti promettenti per le cellule staminali di origine mesenchimale. Infatti, le MSC sono più abbondanti e una vasta gamma di protocolli è stata descritta per il loro isolamento. Tuttavia, è stato riportato che diverse condizioni di coltura dello stesso tipo di cellule possono influenzare il loro modello di espressione genica differenziale, il che rappresenta una limitazione per il loro isolamento ed espansione in vitro. Gli studi che includono l’analisi fenotipica, utilizzando metodologie come la citometria a flusso e l’immunoistochimica, così come la trascrittomica, la proteomica e l’analisi del secretoma, mirano a determinare il profilo proteico di queste cellule (Figura 1). I dati generati da questi studi dovrebbero chiarire il loro repertorio differenziale e convalidare il profilo molecolare di queste cellule staminali. Tuttavia, la questione principale da affrontare è l’isolamento di una popolazione omogenea che possa facilitare gli studi sistematici per l’elucidazione della funzione di queste cellule multipotenti.
Sommario dei marcatori più importanti identificati nelle AFC e AMC mediante l’uso di analisi trascrittomiche, proteomiche, secretomiche e immunofenotipiche. Le proteine identificate in più di uno studio sono segnate in grassetto.
Tali approcci possono portare all’identificazione di antigeni chiave che rispecchiano il fenotipo di queste cellule e spiegano le loro proprietà distinte. Questo tipo di studi aprirà la strada per un isolamento sistematico ed efficiente di queste cellule prima del loro utilizzo in ambito clinico.
Appendice
Domande per ulteriori indagini
Quali sono i metodi di isolamento appropriati e le condizioni di coltura delle AFSCs o AMSCs che permetteranno l’identificazione di un fenotipo coerente?
C’è un unico marcatore che può essere utilizzato per l’isolamento di AFSCs o AMSCs?
Le popolazioni AFSC e AMSC sono eterogenee e differiscono nelle loro proprietà fenotipiche e molecolari. I metodi di isolamento possono risultare in una popolazione cellulare omogenea.
Le AFSC o le AMSC possono essere usate come strumenti nella medicina rigenerativa: creazione di condizioni di coltura con sostanze animali minime o assenti.
Marker Discovery
La caratterizzazione iniziale delle AFSC e delle AMSC può essere eseguita tramite analisi dell’immunofenotipo utilizzando marcatori di superficie cellulare ben caratterizzati come AFSC: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSC: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1, e PROM1.
Transcriptomics and Proteomics Revealed the Identification of Key Markers Expressed such as
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 e Gal; AMSC: OGN, βIG-H3, e CD49F.
Siccome non c’è un marcatore comune disponibile per AFSC e AMSC, un pannello più ampio di marcatori deve essere impiegato. Questo sollecita anche la conduzione di ulteriori analisi dettagliate di array e funzionali al fine di definire i marcatori più appropriati per la caratterizzazione di AFSC e AMSC.
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.