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Molti degli enzimi coinvolti nella biogenesi dei peptidi sono stati identificati

I passi più comuni nella lavorazione dei precursori e gli enzimi coinvolti sono mostrati nella Figura 18-5. Le endoproteasi coinvolte sono le pro-ormone convertasi 1 e 2 (PC1 e PC2), l’esopeptidasi è la carbossipeptidasi E (CPE, chiamata anche CPH e encefalina convertasi) e l’enzima α-amidante è la peptidilglicina α-amidante mono-ossigenasi (PAM). Molte fasi della loro biosintesi non sono uniche per i neuropeptidi, come la scissione del peptide segnale, la formazione di legami disolfuro, l’aggiunta e la successiva modifica di oligosaccaridi legati a N e O, la fosforilazione e la solfatazione. Come illustrato nella Figura 18-3, molti dei passaggi post-traslazionali si verificano come i neuropeptidi in maturazione viaggiano lungo l’assone verso la sinapsi nelle LDCV. Le fasi successive della biosintesi dei neuropeptidi (Fig. 18-5) sono uniche per i neuroni e le cellule endocrine.

Gli enzimi chiave nella biosintesi dei neuropeptidi includono endoproteasi, esoproteasi ed enzimi che modificano le estremità dei peptidi. La scoperta e la caratterizzazione di Kex2p, l’endoproteasi che scinde il fattore di accoppiamento pro-α del lievito per produrre quattro copie del feromone fattore di accoppiamento α (Fig. 18-2), sono state fondamentali per la scoperta delle pro-ormone convertasi dei mammiferi, tra cui furina, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC, e PACE4 . Le pro-ormone convertasi condividono l’omologia con le subtilisine batteriche e hanno una triade catalitica Asp-His-Ser, che consiste di tre aminoacidi chiave coinvolti nella catalisi (indicati come D, H e S nella Fig. 18-5). La proregione di ciascuno (Fig. 18-5) deve essere presente durante la biosintesi perché la proteasi si pieghi correttamente, ma deve essere rimossa per ottenere una proteasi attivata. Per PC1 e furina, la rimozione della proregione avviene entro pochi minuti dalla biosintesi, mentre l’enzima si trova nel reticolo endoplasmatico ed è molto probabilmente un evento autocatalitico. Per le altre pro-ormone convertasi la rimozione della pro-regione è molto più lenta. L’espressione della PC2 attiva richiede la coespressione del peptide 7B2 (Fig. 18-5), che sembra svolgere una funzione di chaperone e può anche impedire l’espressione dell’attività endoproteolitica della PC2 finché la PC2 non è stata depositata nei granuli secretori. Nessun peptide chaperone/inibitore corrispondente è stato identificato per le altre pro-ormone convertasi.

Le endoproteasi dei mammiferi più chiaramente coinvolte nell’elaborazione dei neuropeptidi sono PC1 e PC2, proteasi dipendenti dal Ca2+ che si trovano nei granuli secretori la cui espressione è limitata ai neuroni e alle cellule endocrine (Fig. 18-5). Molti altri membri di questa famiglia di endoproteasi sono più ampiamente espressi, mentre altri ancora sono espressi in luoghi ristretti distinti dai neuroni e dalle cellule endocrine. Per esempio, la furina si trova praticamente in tutte le cellule ed è localizzata principalmente nella rete trans-Golgi; la furina catalizza scissioni importanti nella funzione peptidica, come la scissione iniziale dei precursori dell’ELH, del fattore di crescita nervoso e dell’ormone paratiroideo, così come la scissione all’interno del precursore del recettore dell’insulina per produrre la forma attiva αβ dimero del recettore. La furina può anche essere strumentale nell’attivazione di alcuni degli altri enzimi di elaborazione, come PC2 e CPE.

PC1 e PC2 scindono a coppie selezionate di aminoacidi di base nei precursori peptidici: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys e Arg-Lys. PC1 può anche catalizzare le scissioni ai siti singoli selezionati di Arg presenti in alcuni precursori, come la prosomatostatina e la procolecistochinina. Le scissioni in LDCVs da parte delle PC sono strettamente controllate, spesso avvengono in modo molto ordinato (Fig. 18-6). Le scissioni iniziali di POMC avvengono in meno di 1 ora (Fig. 18-6, passi 1 e 2), mentre altre scissioni avvengono solo dopo diverse ore (Fig. 18-6, passi 6 e 7). La scissione endoproteolitica dei propeptidi è spesso la reazione che limita la velocità nell’elaborazione biosintetica dei peptidi.

Il modello di scissioni catalizzate da PC1, PC2 e furina quando espresso in neuroni e cellule endocrine è molto più selettivo rispetto al modello di scissioni visto in provetta test con enzimi purificati. Per esempio, anche se le convertasi pro-ormone di solito si scindono al COOH-terminale di una coppia di residui basici nei substrati peptidici modello, nelle cellule le scissioni possono essere nel mezzo delle coppie di residui basici, come nel caso della scissione POMC (Fig. 18-6), dove i residui basici sono separati e rimangono con i due peptidi maturi risultanti. È probabile che la concentrazione di Ca2+ e il pH interno delle LDCV siano due variabili utilizzate dai neuroni e dalle cellule endocrine per regolare l’attività endoproteolitica nelle LDCV.

Si può dimostrare che altre endoproteasi svolgono un ruolo nella biosintesi dei neuropeptidi. I principali candidati sono l’omologo mammifero dell’aspartil proteasi-3 del lievito (YAP-3) e la N-arginina dibasica (NRD) convertasi. Una torsione supplementare nella biosintesi del peptide è vista nel cuore, dove il fattore natriuretico proatriale (proANF) è immagazzinato in LDCVs e ancora ANF maturo è rilasciato dalle cellule atriali nella circolazione. L’elaborazione del proANF, che comporta la scissione dopo un singolo residuo Arg nel proANF, non può coinvolgere le PC1 o PC2, poiché nel cuore ci sono quantità trascurabili di queste PC.

CPE è una proteina solubile che si trova praticamente in tutte le LDCV nei neuroni e nelle cellule endocrine (Fig. 18-5) . Rimuove i residui basici, Lys o Arg, dai termini COOH degli intermedi peptidici prodotti dalle pro-ormone convertasi. È stato originariamente identificato dalla sua distribuzione tissutale e dalla specificità del substrato, insieme alla sua specifica inibizione da parte dell’acido guanidinoetilmercaptosuccinico (GEMSA). CPE è un enzima attivato da Co2+- e Zn2+ con una breve proregione che viene normalmente rimossa durante la maturazione dell’enzima; a differenza delle pro-ormone convertasi, CPE è attivo con la proregione attaccata. La funzione di carbossipeptidasi dell’elaborazione dei peptidi non è normalmente limitante dal momento che gli intermedi peptidici con residui basici COOH-terminali sono rilevati solo a concentrazioni estremamente basse negli estratti di tessuto o LDCV. Recentemente, sono state identificate altre carbossipeptidasi, in particolare la CPD, una forma di membrana integrale dell’enzima con 3 domini carbossipeptidasi. L’importanza relativa di CPE e di queste carbossipeptidasi aggiuntive per l’elaborazione dei neuropeptidi in vivo non è chiara. Dato che il clivaggio a una coppia di residui basici può essere al centro della coppia, ci sono buone ragioni per pensare che un’aminopeptidasi si trovi nelle LDCV.

PAM è un enzima bifunzionale trovato in quasi tutte le LDCV (Fig. 18-5) . PAM agisce sui substrati peptidici dopo la scissione endoproteolitica e l’azione esopeptidasica, quando un residuo COOH-terminale Gly è esposto, e converte il peptidil-Gly nel corrispondente peptide-NH2. Circa la metà dei peptidi bioattivi conosciuti sono α-amidati, e l’α-amidazione è generalmente cruciale per la potenza biologica. Le forme peptidyl-Gly e peptide-COOH sono solitamente inattive a concentrazioni fisiologiche. Il primo passo della reazione di α-amidazione viene eseguito dalla peptidilglicina α-idrossilante mono-ossigenasi (PHM), che è la porzione NH2-terminale della proteina bifunzionale PAM. PHM lega due atomi di Cu2+ che partecipano alla catalisi subendo cicli di riduzione e ossidazione. PHM usa l’acido ascorbico come riduttore, con un atomo di ossigeno di O2 incorporato nel peptide durante il passo di idrossilazione. Così, PHM è enzimaticamente molto simile alla β-mono-ossigenasi della dopamina (DBM), che converte la dopamina in norepinefrina (vedi capitolo 12). Il secondo passo della reazione di α-amidazione è eseguito da un secondo dominio enzimatico della PAM, la peptidil-α-idrossiglicina α-amidante liasi (PAL). Il dominio PAL costituisce un nuovo enzima dipendente dagli ioni metallici divalenti. I neuroni esprimono principalmente una forma di membrana integrale della proteina bifunzionale PAM (Fig. 18-5), mentre un ulteriore evento di splicing dell’mRNA permette ad alcune cellule endocrine di esprimere versioni solubili della proteina, senza il dominio transmembrana. Nelle forme di membrana integrale della PAM, il breve dominio COOH-terminale si estende nel citoplasma e partecipa al percorso della PAM tra le LDCV e la superficie cellulare. Il rifornimento di ascorbato ridotto nelle LDCV è mantenuto dal citocromo B561, una proteina che ha cinque domini transmembrana e fa la spola tra l’ascorbato citosolico e l’ascorbato nel lume delle LDCV. Il citocromo B561 si trova anche nelle vescicole contenenti catecolamina, dove svolge una funzione simile per la DBM (vedi cap. 12). I tessuti nervosi ed endocrini mantengono concentrazioni di ascorbato ridotto circa 100 volte al di sopra della concentrazione ematica di ascorbato, mentre la maggior parte degli altri tessuti non concentrano ascorbato.

Alcuni peptidi hanno residui di acido piroglutammico NH2-terminale, chiamati anche acido glutammico ciclico (<Glu), che sono essenziali per la bioattività, per esempio l’ormone di rilascio della tireotropina (TRH) e l’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). L’enzima responsabile di questo passaggio è la glutaminil ciclasi, che converte l’originale NH2-terminale Gln in <Glu. La regolazione e la funzione della glutaminil ciclasi non sono ancora state ampiamente studiate. Un’altra modifica importante ma poco frequente dei peptidi è l’α-N-acetilazione (Figg. 18-6 e 18-7). Durante l’elaborazione di POMC, l’α-N-acetilazione aumenta notevolmente la potenza di scurimento della pelle di ACTH(1-13)NH2 mentre abolisce sia la potenza steroidogenica surrenale di ACTH che l’attività oppiacea di β-endorfina. L’enzima (o gli enzimi) responsabile di questa modifica non è stato ancora purificato o clonato.

Come esempio, la Figura 18-6 mostra il modello di elaborazione fasi nel sistema POMC. I passi endoproteolitici iniziali (Fig. 18-6, passi 1-4) sono mediati da PC1 e si verificano in tutti i neuroni produttori di POMC e cellule endocrine, di solito nell’ordine numerico mostrato. È chiaro che le fasi 1 e 2 sono iniziate nella rete trans-Golgi e continuano nelle LDCV, mentre la fase 4 avviene solo nelle LDCV. Fasi 5-7 si verificano solo in LDCVs e sembrano richiedere PC2. Nell’ipofisi anteriore adulta, corticotropi contengono PC1 ma non PC2 ed eseguire solo scissioni 1-4. Tuttavia, durante il primo sviluppo postnatale, corticotropi anche esprimere PC2 e scissioni 5-7 sono transitoriamente visto in corticotropi. Nel ratto, l’espressione di PC2 e la scissione all’interno di ACTH (scissione 5) diminuiscono simultaneamente poche settimane dopo la nascita, all’incirca nel momento in cui appare il modello adulto di controllo ACTH sulla steroidogenesi surrenale.

Melanotropi e neuroni del SNC che fanno POMC esprimono sia PC1 e PC2 e, quindi, i prodotti peptidici più piccoli sono visti in queste cellule. La PAM è espressa in tutte le cellule produttrici di POMC, quindi l’α-amidazione del peptide di unione (JP), un piccolo peptide senza una chiara funzione biologica, avviene rapidamente in tutte le cellule POMC (Fig. 18-6). Nei melanotropi dell’ipofisi intermedia e nei neuroni POMC del nucleo del tratto solitario si verifica l’α-N-acetilazione dell’ACTH(1-13)NH2 e della β-endorfina. Nei melanotropi, l’α-N-acetilazione dell’ACTH può avvenire prima della scissione 5. Come indicato nella Figura 18-4, le particolari scissioni effettuate e le modifiche apportate ai terminali NH2- e COOH dei prodotti peptidici determinano la miscela di peptidi bioattivi rilasciati.