Il condensatore – diversi tipi. Contrasto nel microscopio
Nel precedente articolo sull’oculare, ho sottolineato che l’oculare era normalmente posizionato in modo che il suo piano focale anteriore fosse coincidente con il piano dell’immagine primaria (PIP). Il PIP è coniugato con il campione nella serie di piani coniugati dell’imaging, e quindi è utile per misurare le caratteristiche dei campioni microscopici.
Allo stesso modo, il piano focale anteriore del condensatore è coniugato con il piano focale posteriore dell’obiettivo (ma non con il campione) nel treno di raggi di illuminazione. Il condensatore, quindi, fornisce un luogo accessibile dove possiamo alterare o regolare il contrasto dell’immagine manipolando i raggi di luce illuminanti. Questi due principi derivano dal metodo di illuminazione di Köhler, che è stato trattato nella parte 3 di questa serie.
La funzione del condensatore
Il condensatore svolge due funzioni nel microscopio. Fornisce un’area di luce uniformemente illuminata nel campo visivo sul piano del campione e illumina l’apertura dell’obiettivo in modo uniforme con una luce di angolo sufficiente ma controllabile. In secondo luogo, come detto sopra, fornisce un mezzo per regolare il contrasto (Bradbury & Evennett, 1996). La forma più semplice di condensatore è lo specchio concavo, ma questo non è utile per obiettivi superiori a NA 0,2 o giù di lì. Se il vostro microscopio ha uno specchio e una fonte di luce remota, il lato piatto dello specchio deve essere utilizzato in combinazione con qualsiasi condensatore di sottostage montato. Questo perché, a rigore, il condensatore dovrebbe ricevere un’illuminazione parallela e quindi portare questa luce a fuoco sul piano focale posteriore del condensatore (dove si trova il campione).
Tipi di condensatore
Il tipo di condensatore più usato è il condensatore di Abbe per la microscopia in campo chiaro (Figura 1a, 1b). È costruito con due o tre lenti, e la lente superiore a fuoco corto può essere di solito capovolta fuori dal percorso ottico (1a), o svitata (1b), per riempire il campo visivo con obiettivi di bassa potenza. Questo semplice illuminatore sarà sufficiente per la maggior parte dei tipi di microscopia. È stato originariamente progettato per fornire fasci stretti (o “matite”) di luce obliqua da un’apertura posizionata eccentricamente nel piano focale anteriore del condensatore. La figura 1c mostra un semplice illuminatore di Abbe a due lenti montato su un apparato di sottostage che poteva essere ruotato e spostato eccentricamente per fornire un’illuminazione obliqua. La figura 1d mostra un condensatore a bassa potenza progettato per riempire completamente il grande campo visivo degli obiettivi a bassissimo ingrandimento.
Anche se un’apertura numerica può essere citata per il condensatore (spesso 0,9 NA per i condensatori a secco e 1,4 NA massimo per i tipi a immersione in olio), queste cifre non danno alcuna indicazione della NA per cui i raggi illuminanti sono corretti per l’aberrazione sferica. In molti condensatori semplici un solido cono di luce per l’illuminazione assiale è raramente corretto per l’aberrazione sferica sopra 0,45 NA. Per lavori di alta qualità e per risolvere strutture al limite della risoluzione, i condensatori devono essere corretti per le aberrazioni. I condensatori completamente corretti, come gli obiettivi, contengono molti elementi di lenti e possono essere corretti quasi allo stesso grado. Il condensatore acromatico-aplanatico (1e) è corretto sia per l’aberrazione sferica che per quella cromatica, e dovrebbe essere usato per lavori di altissima qualità e per la fotomicrografia a colori. I condensatori aplanatici sono corretti solo per l’aberrazione sferica.
I condensatori cosiddetti “universali” (Figura 2) sono multifunzionali. Consistono in un disco girevole che contiene una selezione di diaframmi di apertura, filtri, patch stop, piastre di fase o prismi Wollaston per il contrasto di interferenza differenziale (DIC). Questa disposizione permette di passare da un metodo di contrasto all’altro in modo comodo e facile. Il patch stop a fondo scuro generalmente funziona solo fino a NA 0,5 o giù di lì. Per l’uso con obiettivi di maggiore NA, deve essere usato un condensatore a fondo scuro appositamente costruito (Figura 3). Per i dettagli sul suo uso, e altri metodi di miglioramento del contrasto, vedi Bradbury & Evennett (1996).
Figura 2. Condensatori universali. L’immagine centrale mostra il coperchio superiore rimosso, mostrando il disco girevole dove si trovano gli annuli di fase dell’apertura, i prismi DIC, i patch stop a fondo scuro, i dischi di Rheinberg e i filtri di modulazione Hoffman. La maggior parte dei condensatori universali possiedono un iride di apertura per il lavoro in campo chiaro, diversi annuli per il contrasto di fase e uno stop per il campo scuro a bassa potenza.
Figura 3. Condensatori a terra scura. 3(a) Condensatore a terra scura a secco. 3(b) & 3(c) Condensatori a bagno d’olio a fondo scuro. 3(d) Condensatore a bagno d’olio a fondo scuro regolabile; questo condensatore può essere regolato per adattarsi al diverso spessore del vetrino, per dare un’immagine in fondo scuro di alta qualità.
Microscopia a luce trasmessa e riflessa
La disposizione del microscopio a luce trasmessa richiede un condensatore separato, poiché la luce viene prima condensata sul campione (dove la luce interagisce con la materia), e poi viene raccolta dall’obiettivo più avanti lungo l’asse ottico.
La situazione nel microscopio a luce riflessa è diversa. Qui, il percorso del raggio è piegato intorno all’asse del campione dove la luce viene riflessa dalla sua superficie. L’obiettivo funge da proprio condensatore, e l’allineamento del microscopio a luce riflessa è molto semplificato (vedi i diagrammi dei raggi nella parte 2 di questa serie). Tuttavia, è difficile accedere al piano focale posteriore dell’obiettivo (piano focale anteriore quando viene usato come condensatore), quindi si usano lenti supplementari per creare una posizione in cui l’immagine dei diaframmi e dei filtri sono coniugati con il piano focale posteriore.
Il sistema a luce incidente è molto utile per la microscopia a fluorescenza, principalmente perché l’illuminazione del campione è semplice, è più efficiente (dando immagini più brillanti ad alti ingrandimenti) e la combinazione con altri metodi di contrasto a luce trasmessa è permessa.
Figura 4. Illustrazione di un epi-illuminatore per microscopia a luce riflessa
Questo epi-condensatore ha due tipi di obiettivi a luce riflessa inseriti nella sua ogiva. L’obiettivo in uso è progettato per l’illuminazione del fondo scuro, mentre gli altri due obiettivi che possono essere visti per il lavoro a luce riflessa in campo chiaro. Gli ampi collari intorno a questi ultimi due obiettivi permettono di centrare l’obiettivo sull’asse ottico. La “D” sull’involucro dell’epi-illuminatore denota l’inserto intercambiabile che permette di utilizzare l’unità per l’illuminazione in campo scuro. Può essere scambiato con uno specchio piano per la microscopia a luce riflessa in campo chiaro. Il condensatore a luce trasmessa è stato rimosso da sotto il palco.
Se l’obiettivo agisce come proprio condensatore nella microscopia a luce riflessa, perché gli obiettivi non vengono utilizzati anche per l’illuminazione nella microscopia a luce trasmessa? A parte la difficoltà pratica di accesso al piano focale posteriore dell’obiettivo, è difficile utilizzare gli obiettivi in modo multifunzionale, e l’angolo di illuminazione non è di solito controllabile (da un diaframma a iride nel piano focale posteriore dell’obiettivo).
Principi di base del miglioramento del contrasto
Una visibilità sufficiente, o contrasto, è necessaria per noi per percepire il dettaglio dell’immagine che viene risolto dai nostri microscopi. La selettività è importante: abbiamo bisogno di almeno alcune differenze regionali all’interno dell’oggetto, e tra l’oggetto e lo sfondo, per discernere i dettagli.
Il contrasto nell’immagine è derivato da tre mezzi, separatamente o in combinazione. Essi sono:
- interazione oggetto-luce,
- manipolazione dell’illuminazione, e
- manipolazione del mezzo di registrazione dell’immagine.
La modifica del contrasto nella parte (c) può essere ottenuta tramite sviluppo fotografico e/o stampa, e anche usando il contrasto elettronico di immagini video analogiche o digitali. Tuttavia, il condensatore è strumentale nelle parti (a) e (b) per manipolare il contrasto e la visibilità dell’immagine. Ulteriori dettagli sugli aspetti teorici e pratici delle tecniche di contrasto nella microscopia ottica possono essere trovati in Bradbury & Evennett, 1996 e Sanderson, 2002, 2000, 1998 e 1994. Brevemente, le forme più note di generazione del contrasto sono il campo chiaro, l’illuminazione obliqua, il fondo scuro & Rheinberg, il contrasto di fase e il DIC. È anche possibile combinare questi metodi con diverse forme di illuminazione (per esempio luce polarizzata con Rheinberg, o contrasto di fase da campo chiaro trasmesso con fluorescenza incidente). Poiché l’aumento del contrasto è molto sotto il controllo del microscopista, l’importanza dell’uso corretto del condensatore non può essere troppo sottolineata.
Il condensatore deve essere messo a fuoco correttamente (vedi parte 3, impostazione del microscopio per l’illuminazione Köhler) al fine di ottenere la migliore qualità dell’immagine. Questo è vero qualsiasi metodo di miglioramento del contrasto (campo chiaro, fase, fondo scuro) sia usato. L’effetto più ovvio di un condensatore de-focalizzato nella microscopia in campo chiaro è una significativa perdita di potere risolutivo che dà, a sua volta, un’immagine “marcia” con aloni di diffrazione intorno ad ogni punto dell’immagine. Lo stesso risultato si verifica se la lente superiore (a fuoco corto) viene omessa o lasciata capovolta quando si usa un obiettivo ad alta potenza, e il piano focale posteriore dell’obiettivo non è completamente riempito di luce.
Quando si tenta la microscopia a contrasto di fase con un condensatore mal focalizzato, l’anello nel condensatore spesso non corrisponde al diametro dell’anello di fase nel piano focale posteriore dell’obiettivo, e qualsiasi miglioramento del contrasto viene perso. Problemi di messa a fuoco del condensatore possono anche risultare in una scarsa microscopia a fondo scuro anche, se l’immagine del patch stop non occlude completamente l’illuminazione diretta dall’obiettivo. La prossima parte di questa serie ritorna all’obiettivo, e considera la lunghezza del tubo, e come determinare la lunghezza focale, l’ingrandimento, l’apertura e altri parametri dei vostri obiettivi.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: Una panoramica. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (set di 4 volumi) 0-12-164725-0; solo vol 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.