Après avoir été diplômé de l’Université d’État du Texas du Sud-Ouest à San Marcos, Texas, Boothe a rejoint la compagnie de répertoire du Festival Shakespeare de l’Oregon, avec des rôles dans Henry IV, partie 2 (incarnant Henry IV d’Angleterre), Troilus et Cressida, et autres. Il fait ses débuts sur scène à New York en 1974, dans la production de Richard III du Lincoln Center. Cinq ans plus tard, il a fait ses débuts au théâtre à Broadway dans un rôle principal dans la pièce en un acte Lone Star, écrite par James McLure.
Boothe a d’abord attiré l’attention nationale en 1980, en jouant Jim Jones dans le film de CBS-TV Guyana Tragedy : L’histoire de Jim Jones. Le portrait de Boothe du chef de secte fou a été acclamé par la critique. Dans l’article du Time sur la production, Boothe est loué : « Il y a une performance extraordinaire. Un jeune acteur nommé Powers Boothe capture tout le charisme et le mal de ‘Papa’, Jim Jones. » Boothe a remporté l’Emmy Award pour son rôle, devançant les vétérans Henry Fonda et Jason Robards. Alors que la Screen Actors Guild était en grève à l’automne 1980, il fut le seul acteur à franchir les piquets de grève pour assister aux cérémonies, déclarant à l’époque : « C’est peut-être soit le moment le plus courageux de ma carrière, soit le plus stupide. »
Boothe a incarné Philip Marlowe dans une série télévisée basée sur les nouvelles de Raymond Chandler pour HBO dans les années 1980. Il est apparu dans des films tels que Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire et Extreme Prejudice, ainsi que dans les films de HBO Into the Homeland et By Dawn’s Early Light. En outre, il est apparu dans le film Family of Spies de CBS-TV en 1990, dans lequel il jouait le rôle de l’officier de marine traître John Walker. Boothe a interprété Curly Bill Brocius dans le western à succès Tombstone (1993), l’officier supérieur déloyal de l’armée dans Blue Sky (face à Jessica Lange, dont la performance a été récompensée par un Oscar), et le sinistre terroriste principal dans Sudden Death. Il a également fait partie de la grande distribution des films d’Oliver Stone Nixon (dans le rôle du chef d’état-major Alexander Haig) et U Turn (dans le rôle du shérif de la ville).
En 2001, il a joué le rôle de Flavius Aëtius, le général romain chargé d’arrêter l’invasion des Huns dans la mini-série télévisée Attila. Boothe a joué le rôle du propriétaire de bordels Cy Tolliver dans la série Deadwood sur HBO, et le sénateur miteux Roark dans le film Sin City (2005), ainsi que dans sa suite, Sin City : A Dame to Kill For (2014). Il est la voix d’un des personnages du jeu vidéo Area 51 (2005) et de Gorilla Grodd, le super-vilain télépathe hyper-intelligent dans Justice League et Justice League Unlimited. Il a fait la voix du méchant, Kane, dans le jeu vidéo Turok de 2008.
Il a été une guest star spéciale de la série 24, où il a joué le vice-président Noah Daniels. Il est revenu dans le préquel de la septième saison, 24 : Redemption. Juste après avoir pris le rôle du président par intérim, Boothe est vu sortant d’Air Force Two avec des F-15 en arrière-plan. Boothe a joué le rôle d’un pilote de F-15 abattu dans Red Dawn. En mars 2008, il a fait la narration d’une publicité de campagne télévisée pour la campagne présidentielle du sénateur John McCain.
En 2012, Boothe est apparu dans The Avengers de Joss Whedon dans un rôle secret de supérieur gouvernemental ombrageux du S.H.I.E.L.D. En 2015-16, il a repris le rôle, désormais nommé Gideon Malick, dans la série Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe est apparu dans la mini-série Hatfields & McCoys de 2012 dans le rôle du juge Valentine « Wall » Hatfield. Boothe a également joué le rôle de Lamar Wyatt dans la série dramatique musicale d’ABC, Nashville. Boothe a également prêté sa voix à Hitman : Absolution, un jeu vidéo de 2012 développé par IO Interactive, en interprétant le personnage de Benjamin Travis.