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Les streptocoques sont les habitants les plus abondants de la bouche humaine (6, 24), et ils accèdent fréquemment à la circulation sanguine par le biais de lésions parodontales ou d’abrasions buccales créées par des activités de routine (32). Cela peut entraîner des maladies graves, notamment l’endocardite infectieuse (EI) (28) et la bactériémie neutropénique (29). La taxonomie des streptocoques oraux a longtemps été une source de confusion (4, 9, 20, 22, 31). Le séquençage du gène de l’ARNr 16S a permis de clarifier considérablement la situation (13) ; toutefois, cette approche n’a pas la sensibilité requise pour distinguer certaines espèces étroitement apparentées, notamment Streptococcus mitis et Streptococcus oralis (12), ou pour permettre le typage des souches ou l’analyse phylogénétique au sein des espèces. Des gènes possédant une plus grande variabilité ont donc été examinés, notamment l’espaceur transcrit intergénique (ITS) de l’ARNr 16S-23S (2), des gènes domestiques codant pour des protéines (1, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 23), ou les deux (17, 18). Un consensus concernant le(s) gène(s) le(s) mieux adapté(s) à ces fins n’a pas encore émergé. En outre, bien que des études antérieures aient identifié des streptocoques oraux à partir d’hémocultures cliniques en utilisant des méthodes de séquençage définitives (12, 23, 30), aucune n’a rapporté d’informations cliniques détaillées sur la maladie sous-jacente. Nous avons entrepris de faire les deux.

Les cultures de sang réalisées à l’hôpital du centre médical de l’université Virginia Commonwealth de mai 2003 à mai 2008 ont été identifiées par présomption comme contenant des streptocoques par le laboratoire de microbiologie clinique. Un script informatique a été utilisé pour exclure les espèces non orales. Pour éviter l’analyse des contaminants, des plaques d’isolement ont été demandées uniquement lorsque deux rapports ou plus provenaient de cultures distinctes du même patient. Une colonie de chaque plaque d’isolement disponible a été cultivée en bouillon de culture et examinée au macroscope et au microscope. Si des différences étaient observées dans les cultures séparées provenant du même patient, les deux cultures étaient conservées. Sinon, une seule culture de chaque patient a été cryoconservée et des aliquotes ont été prélevés pour l’amplification par PCR.

Pour déterminer l’identité de l’espèce et la parenté phylogénétique de chaque isolat, l’ITS 16S-23S a été amplifié en utilisant les amorces 6R et 13BF décrites précédemment (2). Lorsque les produits n’ont pas été obtenus de certains isolats, nous avons noté que les trois derniers nucléotides de l’amorce 6R ne s’alignaient pas avec les séquences d’ARNr 23S dans GenBank de plusieurs espèces d’intérêt. Nous avons donc raccourci et simplifié l’amorce 6R, créant ainsi la 6R-S, et raccourci l’amorce 13BF pour l’adapter à sa température d’hybridation (voir le tableau S1 dans le matériel supplémentaire). Une modification similaire de l’amorce 6R a été rapportée récemment (18). En utilisant ces amorces, des amplicons PCR ont été obtenus à partir de tous les isolats et soumis à une analyse de séquence d’ADN capillaire.

La plupart des séquences d’ADN contenaient l’ITS complet et des portions des gènes d’ARNr 16S et 23S, qui ont été alignées avec les séquences ITS des souches types disponibles dans GenBank ou déterminées par nous à partir de souches obtenues à partir de l’American Type Culture Collection (ATCC). Nous avons constaté que les séquences flanquantes 16S et 23S, bien que non conservées dans la plupart des séquences publiées, facilitaient l’alignement ITS. En effet, au moins quatre séquences de souches types ont été publiées (18) dans lesquelles un CTAAGG situé 78 pb avant l’extrémité 3′ du gène de l’ARNr 16S semble avoir été confondu avec une séquence hexanucléotidique identique définie précédemment (2) comme le début de l’ITS. Les séquences ITS rognées (2) ont ensuite été comparées et alignées avec le logiciel MEGA 4 (25) pour construire un arbre phylogénétique à jointure de voisinage (Fig. 1).

Il a été suggéré précédemment que l’analyse ITS seule est suffisante pour l’identification des espèces de streptocoques oraux, y compris celle des espèces étroitement apparentées S. mitis et S. oralis. Il a été suggéré que des délétions conservées d’une seule base sur deux sites et une longueur totale de l’ITS de 246 pb étaient caractéristiques de S. oralis, tandis qu’il a été proposé que S. mitis n’ait pas de délétions et possède un ITS de 248 à 249 pb (2, 3). Dans notre étude, nous avons trouvé des isolats des deux espèces qui possédaient les deux délétions ou aucune, ainsi que des longueurs d’ITS se chevauchant. Ainsi, les isolats de S. oralis et S. mitis n’ont pas pu être distingués de manière fiable par ces critères. Une autre étude a suggéré que l’analyse de la séquence ITS, bien qu’elle ne soit pas suffisante pour distinguer S. oralis et S. mitis, est suffisante pour l’identification de nombreuses autres espèces de streptocoques oraux, y compris celles appartenant au groupe anginosus (18). Cependant, nous avons trouvé un isolat de l’espèce S. intermedius du groupe anginosus (VMC38) qui n’a pas pu être classé par ITS (voir le tableau S1 dans le matériel supplémentaire).

Un grand nombre d’isolats, en particulier pour S. mitis et Streptococcus constellatus, possédaient également des séquences identiques, empêchant l’analyse phylogénétique. Des séquences identiques ont également été obtenues à partir de cinq paires d’isolats provenant des mêmes patients (données non présentées).

Parce que l’analyse ITS n’était pas suffisante pour nos objectifs, nous avons séquencé une deuxième cible commune-le gène sodA, codant pour la superoxyde dismutase manganèse-dépendante (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Cela a permis d’exclure plusieurs isolats. Les paires de souches mentionnées ci-dessus comme provenant des mêmes sujets et ayant des séquences ITS identiques possédaient également des séquences sodA identiques, confirmant que les isolats étaient identiques, et un isolat de chaque paire a été éliminé. Deux isolats ont été abandonnés en raison d’une erreur apparente dans la manipulation des souches, et un autre n’a pas été retenu car les séquences ITS et sodA indiquaient qu’il s’agissait d’une souche d’Enterococcus faecalis. Un arbre phylogénétique dérivé des isolats restants est présenté à la figure 1.

L’alignement sodA était supérieur à celui de l’ITS pour l’analyse phylogénétique. Les seuls isolats ayant des séquences sodA identiques étaient deux souches de S. mitis et deux souches de Streptococcus vestibularis. L’alignement sodA était également plus utile pour la détermination des espèces. Toutes les souches de référence étaient bien séparées les unes des autres dans l’arbre phylogénétique. Il en résulte seulement quatre assignations d’espèces ambiguës pour sodA, contre 15 pour l’ITS (voir le tableau S1 dans le matériel supplémentaire). Dans les cas où une seule désignation d’espèce était cohérente avec les séquences ITS et sodA, cette désignation a été utilisée. Seuls 3 des 58 isolats cliniques finaux n’ont pu être identifiés avec certitude par cette méthode. Les isolats VMC1 et VMC43 ont produit des séquences ITS trop courtes pour être informatives, malgré des tentatives de séquençage répétées, et le VMC58 a été identifié de manière incohérente par les séquences ITS et sodA (Fig. 1 ; Tableau S1). Nous avons confirmé l’identité d’espèce de ces isolats en utilisant une base de données récemment publiée contenant les séquences de sept gènes domestiques de 420 souches streptococciques bien caractérisées, y compris sodA, pfl et pyk (1). Les séquences des gènes pfl et/ou pyk de toutes les souches douteuses ont été déterminées et alignées avec les séquences de la base de données eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), tout comme les séquences sodA existantes. Dans tous les cas, les assignations des espèces pfl et pyk étaient en accord avec celles de sodA. De plus, l’alignement sodA a indiqué que la séquence VMC58, bien que divergente de la souche type, faisait partie d’un groupe de 13 isolats de Streptococcus infantis dans la base de données (données non présentées). L’identification consensuelle des espèces de tous les isolats inclus dans l’étude est indiquée dans la figure 1 et les tableaux S1 et S2 dans le matériel supplémentaire.

Bien que ces résultats suggèrent que l’analyse sodA seule est suffisante pour identifier la plupart des souches, nous recommandons l’inclusion d’au moins un gène d’entretien codant pour une protéine supplémentaire pour toutes les souches. De nombreux streptocoques oraux sont naturellement compétents, et des cas d’acquisition de gènes de maintien étrangers, y compris sodA, ont été signalés (1, 12). Cela n’était pas apparent dans notre étude, mais il y avait des cas de séquences ITS (VMC38 et VMC50) et sodA (VMC33) chimériques. Deux publications récentes sont allées plus loin, chacune suggérant le séquençage d’un ensemble différent de sept gènes de maintien pour le typage de séquence multilocus (7) ou l’analyse de séquence multilocus (1). Ces approches reposent sur l’analyse d’un plus grand nombre de gènes afin de fournir une résolution accrue et de minimiser les effets des gènes chimériques ou étrangers occasionnels (1, 7). Ces schémas permettent également des analyses phylogénétiques plus sophistiquées que celles qui sont possibles avec seulement deux ou trois gènes. Nous avons cependant rencontré des difficultés occasionnelles pour l’amplification et le séquençage de pfl et pyk et peu de succès avec deux des autres gènes recommandés, map et ppaC (1). Une autre étude récente a rapporté des difficultés similaires (27). Ainsi, le choix de gènes supplémentaires peut nécessiter des tests empiriques, mais ceux employés dans les analyses à sept gènes devraient être explorés en premier, puisque de grandes collections de séquences provenant de souches bien caractérisées sont disponibles pour comparaison (1, 7).

À notre connaissance, il s’agit seulement du deuxième rapport d’un isolat d’hémoculture de Streptococcus australis (12) ou de S. infantis (30). La seule autre association de cette dernière espèce avec une quelconque maladie provient de deux rapports de son isolement dans les expectorations d’adultes atteints de mucoviscidose (17, 26). Il est donc intéressant qu’un adulte atteint de mucoviscidose ait été la source de notre isolat de S. infantis, VMC58 (voir le tableau S2 dans le matériel supplémentaire).

Les données de sensibilité aux antibiotiques sont incluses dans le tableau S2 et sont largement en accord avec les études précédentes (8). Le tableau S2 présente également les données cliniques et démographiques des patients sources, en les classant par catégorie en fonction de la principale maladie sous-jacente : maladie médicale, malignité, EI ou chirurgie/traumatisme. Tous les sujets atteints d’EI ont été diagnostiqués cliniquement et tous, à l’exception du cas du VMC56 (tableau S2), ont été classés comme  » EI certaine  » selon les critères modifiés de Duke (16). Le seul cas d’exception présentait des antécédents d’EI et d’utilisation de drogues par voie intraveineuse (UDI), ce qui, avec les hémocultures positives, aurait permis de le classer dans la catégorie  » EI possible « . Les données sur les sources possibles d’infection, notamment les cathéters centraux, l’endoscopie gastro-intestinale, la mucosité buccale, les affections dentaires et l’UDI, ont également été examinées. Une UDI a été trouvée chez 9 des 13 patients atteints d’EI et chez un seul autre patient de l’étude (tableau S2). Cette différence était statistiquement significative (P < 0,0001 ; test exact de Fisher). Ainsi, bien que cette étude se soit concentrée sur les espèces orales, l’UDI était un facteur de risque écrasant.

Notre analyse phylogénétique n’a révélé aucune association statistiquement significative entre une espèce ou un type clonal particulier et la maladie sous-jacente ou d’autres paramètres cliniques, notamment le nombre de globules blancs, la température la plus élevée, la taille de la végétation, la valve touchée ou le décès du patient. Une étude précédente contenait suffisamment d’informations pour identifier les espèces isolées chez les patients neutropéniques (12). Nos résultats étaient similaires, en ce sens que 11 des 12 isolats dans cette étude et 9 des 10 dans la nôtre (tableau S2) étaient soit S. mitis, soit S. oralis, espèce étroitement apparentée. Dans notre étude, ces deux espèces, prises ensemble, étaient significativement plus susceptibles que les 12 autres espèces combinées d’être isolées de patients neutropéniques (P = 0,004 ; test exact de Fisher). Cela peut refléter la prévalence de ces espèces dans la cavité buccale. Il est toutefois intéressant de noter que cette tendance ne s’est pas reportée sur les EI. En combinant nos données avec celles de la même étude (12) pour la neutropénie et l’EI, S. oralis et S. mitis ont été isolés dans 20 des 22 cas de neutropénie et seulement 15 des 27 cas d’EI, une différence statistiquement significative (P = 0,01 ; test exact de Fisher). Comme dans les études précédentes (11, 12, 30), le nombre d’échantillons a limité notre capacité à évaluer avec confiance d’autres associations possibles entre les espèces et certaines maladies ou caractéristiques cliniques. Cependant, en jumelant l’identification définitive des espèces avec les caractéristiques cliniques et démographiques de chaque patient source (tableau S2), nous avons cherché à rendre nos résultats adaptés à une méta-analyse ou à d’autres études utilisant des données combinées.

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