La figure 2(a) illustre le profil d’émission de fluorescence à l’aide du bloc-filtre DAPI-FITC et d’une culture de cellules fibroblastiques de peau de cerf Muntjac indien colorées avec du Alexa Fluor 488 conjugué à la phalloïdine, qui se lie au réseau d’actine filamenteuse intracellulaire. Le maximum d’absorption de la lumière visible du Fluor Alexa 488 est de 495 nanomètres et le maximum d’émission se situe à 519 nanomètres dans la région verte du spectre. En outre, l’échantillon a été coloré simultanément avec du DAPI (ciblant l’ADN dans le noyau cellulaire ; excitation à 358 nanomètres et émission à 461 nanomètres) et du MitoTracker Red CMXRos (ciblant les mitochondries ; émission rouge). Notez l’absence de signal du fluorophore rouge (MitoTracker), mais la présence de la fluorescence verte brillante exposée par les filaments d’actine et le signal bleu d’intensité légèrement plus faible du DAPI dans le noyau cellulaire.
Une coupe fine d’intestin de souris colorée avec de l’agglutinine de germe de blé Alexa Fluor 350, une lectine fluorescente bleue spécifique du mucus des cellules de gobelet, est présentée sur la figure 2(b). En outre, le spécimen a été coloré simultanément avec la phalloïdine Alexa Fluor 568 (actine filamenteuse ; émission de 600 nanomètres) et le vert SYTOX (noyaux ; excitation de 504 nanomètres et émission de 523 nanomètres). Notez le faible niveau de signal du fluorophore bleu (Alexa Fluor 350), mais la fluorescence verte brillante des noyaux dans l’échantillon de tissu due à la fluorescence du vert SYTOX. Cette combinaison de filtres d’excitation doubles élimine efficacement le signal de la sonde rouge (Alexa Fluor 568).
La figure 2(c) montre l’intensité de l’émission de fluorescence d’une culture de cellules épithéliales de rat kangourou (PtK2) qui ont été marquées par immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux primaires de souris anti-bovine alpha-tubuline suivis de fragments Fab de chèvre anti-souris conjugués à Alexa Fluor 488. En outre, l’échantillon a été marqué au Hoechst 33258, qui se lie sélectivement à l’ADN dans le noyau cellulaire, et au MitoTracker Red CMXRos (ciblant les mitochondries ; fluorescence rouge). Notez la coloration verte proéminente du réseau intracellulaire de microtubules qui s’étend dans tout le cytoplasme, et l’émission bleue du Hoechst 33258 lié à l’ADN dans le noyau. La cellule dans la partie inférieure de l’image semble subir une mitose à l’état de prométaphase ou de métaphase.
Les cellules de souris suisse (lignée 3T3) marquées par immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux primaires de souris anti-cytochrome oxydase suivis de fragments Fab de chèvre anti-souris conjugués à Alexa Fluor 568 sont illustrées dans la figure 2(d). Le spécimen a également été marqué avec plusieurs sondes supplémentaires, notamment la lectine Helix pomatia agglutinininin (HPA) conjuguée à l’Alexa Fluor 488 (émission verte), qui se lie sélectivement aux glycoprotéines de l’appareil de Golgi dans cette lignée cellulaire. Les filaments d’actine du cytosquelette ont été colorés avec l’Alexa Fluor 680 (excitation rouge ; émission proche de l’infrarouge) et l’ADN nucléaire a été marqué avec le DAPI (émission bleue). Notez la coloration verte proéminente de l’appareil de Golgi et l’intensité de fluorescence bleue observée dans les noyaux.
L’émission de fluorescence d’une section mince de rein de souris colorée avec de multiples (3) fluorophores est présentée sur la figure 2(e). Les noyaux dans la section de tissu ont été ciblés avec la sonde d’acide nucléique DAPI, qui a un maximum d’excitation à 358 nanomètres et un maximum d’émission à 461 nanomètres lorsqu’elle est liée à l’ADN dans les cultures cellulaires et les sections de tissu. En outre, la section du cryostat a été colorée simultanément avec l’agglutinine de germe de blé Alexa Fluor 488 (glomérules et tubules convolutés) et la phalloïdine Alexa Fluor 568 (actine filamenteuse et bordure en brosse). Notez la présence du signal des sondes bleue (DAPI) et verte (Alexa Fluor 488), mais l’absence de fluorescence rouge-orange due aux conjugués d’Alexa Fluor 568 dans les réseaux d’actine et de bordure en brosse.
L’émission d’autofluorescence d’une section mince de grain de maïs (Zea mays) est démontrée dans la figure 2(f). L’autofluorescence endogène dans les tissus végétaux provient d’une variété de biomolécules, y compris la chlorophylle, le carotène et la xanthophylle. Dans les régions d’excitation ultraviolette et bleue, la chlorophylle possède une bande d’absorption avec un coefficient d’extinction élevé et produit une quantité importante de fluorescence lorsqu’elle est excitée avec des longueurs d’onde comprises entre 350 et 500 nanomètres. Pour le tissu du grain de maïs illustré ci-dessus, notez la présence d’une intensité d’émission d’autofluorescence dans les régions spectrales bleue et verte, qui est caractéristique de la combinaison de filtres de fluorescence DAPI-FITC de Nikon.