Les dNTP signifient nucléotide triphosphate désoxyribose employé dans la PCR pour étendre le brin d’ADN en croissance. dATP, dTTP, dGTP et dTTP sont quatre dNTP communs utilisés dans la PCR.
La fonction des dNTP dans la PCR est d’étendre le brin d’ADN en croissance avec l’aide de l’ADN polymérase Taq. Elle se lie avec le brin d’ADN complémentaire par des liaisons hydrogène.
La PCR est une technique in vitro de synthèse d’ADN. Le but de la réalisation de la PCR est de générer de multiples copies des fragments d’ADN qui nous intéressent pour le visualiser sous l’électrophorèse sur gel.
Le but de la PCR est de faire des millions de copies d’ADN pour diverses applications en aval comme le séquençage de l’ADN ou les puces à ADN.
La réaction en chaîne par polymérase est l’outil inégalé utilisé dans la recherche génétique moléculaire depuis sa découverte. Une matrice d’ADN, des amorces, un tampon, une ADN polymérase Taq et des dNTP sont les ingrédients de la PCR. Pour comprendre le mécanisme de la PCR, nous devrions avoir à apprendre l’importance de chaque ingrédient utilisé dans celle-ci,
Dans cet article, Nous abordons l’un des ingrédients clés de la PCR qui est les dNTPs. Nous examinerons également sa structure et pourquoi il est si important.
De plus, nous parlerons également du mécanisme d’interaction des dNTP et de l’ADN polymérase Taq et de leur travail sur le brin d’ADN en croissance.
De plus, nous parlerons du mécanisme d’interaction des dNTP et de l’ADN polymérase qui aide à faire croître le brin d’ADN.
Lisez plus loin les articles relatifs à la PCR,
- Rôle du DMSO dans la PCR : Le DMSO est un amplificateur de PCR
- Fonction de l’ADN polymérase taq dans la PCR
- Lignes directrices pour la conception des amorces de PCR
- Rôle de MgCl2 dans la réaction de PCR
Thèmes clés:
Que sont les dNTP ?
Les dNTP sont les nucléotides artificiels utilisés dans la PCR pour synthétiser de nouveaux brins d’ADN un peu comme la réplication de l’ADN. dATP, dTTP, dGTP, dTTP sont des nucléotides courants présents dans le mélange maître de la PCR.
Structure des dNTP :
Le dNTP signifie désoxyribose nucléotide triphosphate.
D’abord, nous devons comprendre plusieurs terminologies de base telles que base, nucléotides, nucléosides, ribonucléotides, désoxyribonucléotides, didésoxy ribonucléotides afin de comprendre les dNTPs. Ce sont des termes de base couramment utilisés en génétique, pourtant, les gens l’ont mal compris.
L’adénine et la guanine sont des bases puriques tandis que la cytosine et la thymine sont des bases pyrimidiques. Les bases azotées ne peuvent pas former directement l’ADN. Un squelette phosphate et un sucre pentose sont en outre nécessaires pour créer une molécule d’ADN.
Le nucléotide est constitué d’un sucre pentose, d’un phosphate et d’une base azotée. Un nucléotide se lie avec un autre nucléotide adjacent avec une liaison phosphodiester tandis qu’un nucléotide se lie avec un autre nucléotide sur le brin d’ADN opposé avec des liaisons hydrogène.
L’image représente la structure du désoxyribose triphosphate, diphosphate et monophosphate.
Lisez plus loin sur la structure de l’ADN : L’histoire de l’ADN : La structure et la fonction de l’ADN
Le phosphate présent dans le nucléotide est le triphosphate, (tri- trois) lorsque le phosphate n’est pas lié au nucléotide (ou absent), il est appelé comme un nucléoside (le nucléotide sans phosphate est appelé nucléoside).
Lorsqu’un atome d’hydrogène remplace le groupe hydroxyle dans le sucre pentose, le sucre est appelé un sucre désoxy. L’ADN est constitué de sucre pentose désoxy tandis que l’ARN est constitué du seul sucre ribose.
Les dNTP sont la chaîne de nucléotides constituée de ribose, de base azotée et de phosphate.
De plus, les ddNTP sont différents des dNTP.
Le didésoxynucléotide triphosphate ne possède pas de groupe 3′ OH libre, un autre groupe 3′ OH du sucre est remplacé par un hydrogène.
Il ne peut donc pas provoquer l’expansion d’un brin d’ADN en croissance. Donc ces types de ddATP, ddTTP, ddCTP et ddGTP sont utilisés dans le séquençage de l’ADN. Nous discuterons du rôle des ddNTP dans le séquençage de manière élaborée dans un autre article.
Les ddNTP sont utilisés dans la méthode de terminaison de chaîne pour arrêter l’expansion de la synthèse de l’ADN.
L’image représente la différence entre le sucre Ribose, le sucre désoxyribose et le sucre désoxyribose.
Le triphosphate est composé de trois molécules différentes de phosphate qui fournit un squelette à l’ADN.
Le squelette phosphate de l’ADN comporte trois molécules de phosphate différentes appelées phosphate alpha, bêta et gamma. Lorsqu’un phosphate ou un phosphate gamma est libéré, la structure est appelée désoxynucléotide diphosphate.
De même, lorsque deux des trois phosphates sont libérés, la structure est appelée désoxynucléotide monophosphate.
Le dATP et le dGTP sont des purines tandis que le dCTP et le dTTP sont des dNTP pyrimidines utilisés dans la réaction PCR. La fonction des dNTP dans la PCR est la même que dans la réplication in vivo. Si vous êtes intéressé à lire les différences entre nucléotides vs nucléosides et purines vs pyrimidines lisez ces articles :
- Purines Vs Pyrimidines
- Nucléotides Vs Nucléosides
L’image représente quatre différents dNTPs structure.
La fonction des dNTPs :
Les dNTP sont les ingrédients de la PCR, de la RT-PCR, du séquençage de l’ADN ou des microréseaux d’ADN qui aident à la croissance de l’ADN ou à l’amplification de l’ADN.
Mécanisme d’action :
Le processus de la PCR est divisé en trois étapes dépendant de la température :
- Dénaturation
- Annexion
- Extension.
Dans l’étape de dénaturation, l’ADN double brin est dénaturé en ADN simple brin ; Dans l’étape de recuit, l’amorce se lie à la position exacte de l’endroit où sa séquence complémentaire est présente et,
Dans l’étape d’extension, l’ADN polymérase Taq ajoute les dNTP au brin d’ADN en croissance.
Une fois que le brin est ouvert et que l’amorce se lie avec l’ADN simple brin, l’ADN polymérase Taq commence son activité catalytique.
L’ADN polymérase Taq utilise l’ADN simple brin comme substrat pour l’activité enzymatique et s’est installée sur la jonction amorce-ADN.
L’une des extrémités de l’ADN polymérase Taq se fixe près du groupe 3′ OH de l’amorce oligonucléotidique, ce complexe est appelé complexe P-ADN.
L’image représente la structure de l’ADN avec les liaisons hydrogène et la liaison phosphodiester de l’ADN.
Dans l’étape suivante, l’addition de dNTP a commencé.
Le dNTP se lie avec le complexe P-ADN avec une faible affinité si le nucléotide complémentaire exact est présent. Peu après, l’ADN polymérase Taq le retient et l’interaction par liaison hydrogène entre une base complémentaire et le dNTP se produit.
Ici, au début, ce n’est pas le nucléotide entier mais la base (base azotée) présente sur le dNTP qui décide de se lier ou non.
D’abord, si elle trouve la base complémentaire sur l’ADNss matrice (A pour T et G pour C), elle va former les liaisons hydrogène entre elles. Trois liaisons hydrogène entre C et G et deux liaisons hydrogène entre A et T sont fabriquées.
Une fois la liaison hydrogène formée, l’ADN polymérase Taq conforme cette liaison de dNTP avec le brin d’ADN en croissance en formant une liaison phosphodiester. Maintenant, après la formation de la liaison phosphodiester, l’ADN polymérase Taq avance d’un pas pour ajouter de nouveaux dNTP.
La liaison phosphodiester est formée entre 3′ OH de l’amorce et 5′ P du dNTP.
Après la formation de la liaison hydrogène, l’ADN polymérase Taq catalyse la réaction en éliminant le gamma et le bêta-phosphate du triphosphate du dNTP. Deux pyrophosphates (PPi) sont libérés après l’achèvement de la réaction.
La cinétique exacte de l’interaction entre les dNTP et la Taq polymérase au cours de la réaction PCR n’est toujours pas connue.
Lire la suite sur une électrophorèse en gel d’agarose,
- Électrophorèse en gel d’agarose
- Colorant de chargement du gel d’ADN
- Rôle de l’EtBr dans l’électrophorèse en gel d’agarose
La concentration des dNTP dans la PCR :
En général, pour une réaction de PCR avec 30 à 35 cycles d’une série, 200μM de chaque dNTP sont suffisants.
200μM chacun ce qui signifie qu’un total de 800μM de 4 mélanges de dNTPs est utilisé dans une seule réaction PCR. Nous devons préparer notre concentration de travail à partir de la solution mère de 100mM.
Cependant, ces derniers jours, le mastermix prêt à l’emploi est très populaire et efficace. Le mastermix prêt à l’emploi contient tous les ingrédients importants tels que le mélange de dNTPs, le colorant de chargement de gel et l’ADN polymérase Taq.
Comme nous sommes un étudiant en sciences, nous devons apprendre, comment préparer la solution de travail à partir du stock. Supposons que nous devons préparer 2mM de travail à partir des 100mM de stock.
Maintenant,
Souvenez-vous de V1C1= V2C2 ?
Ici, la concentration donnée C1 est 100mM (qui est la concentration du stock de dNTPs)
V1 est le volume donné est inconnu ( ?)
C2 est la concentration requise = 2mM
V2 est le volume requis= 1000μL
Donc V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Ici, 20μL de chaque dNTPs nécessaires pour la préparation de la solution de travail, donc le volume final pour notre mélange est de 80μL de (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) dans 920μL de D/W.
Cela fera une concentration finale de 2mM de chaque dNTP dans 1000μL de solution de travail. Calculez vous-même pour 200μM.
Mon guide ultime pour l’utilisation des dNTP en PCR
Toujours préparer deux tubes de solution mère et stocker tous les tubes à -20°C.
Calculez le nombre de réactions que vous effectuez en une semaine en conséquence préparez la solution de travail à partir du stock et stockez-la à 4°C. Car les congélations et décongélations répétées diminuent l’activité des dNTP.
Toujours porter des lunettes et maintenir des conditions stériles lors de la préparation de la solution de travail, car la contamination d’un ADN étranger gênera dans la réaction PCR.
La concentration de 200μM est suffisante pour la réaction PCR, cependant, pour la PCR à longue portée, une concentration de 2mM à 3 mM de chaque dNTP peut être utilisée.
Lorsque la concentration de dNTP augmente, le taux de liaison non spécifique augmente. De même, la rareté des dNTP conduit à des produits PCR incomplets. Il faut donc toujours utiliser une quantité appropriée de dNTPs.
Conclusion :
En conclusion, La fonction des dNTP dans la réaction PCR est aussi importante que l’ADN polymérase Taq.
Avec l’aide de la Taq, les dNTP se lient avec le brin d’ADN en croissance et l’étendent. Si vous ne voulez pas vous embêter avec tout ça, vous pouvez utiliser un kit PCR prêt à l’emploi qui est plus préférable. Pourtant, vous devez apprendre la méthode manuelle de préparation des réactifs.